趙 麗， 郭云良

(青島大學附屬醫(yī)院腦血管病研究所，山東 青島 266003)

髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種具有重要功能的髓鞘結(jié)構(gòu)蛋白[1]，位于髓鞘漿膜面，與髓鞘脂質(zhì)緊密結(jié)合，利于穩(wěn)定中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的結(jié)構(gòu)和功能[2]，且具有神經(jīng)組織特異性[3]。MBP缺乏將會導(dǎo)致髓鞘形成障礙，其水平變化可以反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷及髓鞘損傷的嚴重程度[4]，足量的MBP對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)非常重要[5]。動物實驗證明[6]，正常成年大鼠腦內(nèi)有少量的MBP mRNA的表達，腦缺血損傷早期MBP mRNA[7]和MBP蛋白[8]表達降低，并且降低程度具有時間依賴性[9]。但隨著缺血時間的推移，MBP mRNA的表達緩慢上升，在第7天表達明顯高于損傷后第1天的表達量。段建剛等[10]研究表明，針刺治療能上調(diào)MBP表達，促進髓鞘的再生。胡黃連苷Ⅱ的抗氧化、抗炎、抗凋亡作用已經(jīng)得到證實[11-12]，但具有神經(jīng)保護作用的中藥活性成分能否影響MBP表達水平，迄今尚未見報道。本課題組的前期工作從大鼠神經(jīng)行為功能、腦梗死體積和免疫組化染色等方面，探討胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血再灌注損傷劑量和時間窗，發(fā)現(xiàn)在腦缺血1.5 h，腹腔注射胡黃連苷Ⅱ 20 mg/kg時其腦保護作用最強[13-14]。鑒于神經(jīng)行為學評價和免疫組化染色受主觀因素影響較大，結(jié)果難免存在局限性。本次實驗試圖應(yīng)用多種生物學方法定性及定量地檢測腦組織中MBP表達水平及髓鞘的結(jié)構(gòu)變化，深入探討胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷的作用及其最佳治療劑量和時間窗。

材 料 和 方 法

1 動物模型

成年健康雄性SPF級Wistar大鼠200只，體重230～250 g，青島市藥物檢驗所實驗動物中心提供[SCXK(魯)20100010]。動物置實驗室適應(yīng)環(huán)境1周，自由進食、飲水；室溫(23±2) ℃，自然光照。隨機抽取5×3只為對照組，其余185只用于建立腦缺血模型。術(shù)前動物禁食12 h，經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL/kg)，仰臥固定、無菌操作，頸部正中切口，分離并結(jié)扎雙側(cè)經(jīng)總動脈(bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO)建立前腦缺血模型[15-16]，術(shù)中保持動物肛溫36～37 ℃。術(shù)后2 h仍未蘇醒或死亡的26只動物剔除，成模共159只納入統(tǒng)計范圍。對照組大鼠不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，其余操作同實驗組。

2 設(shè)計分組和干預(yù)措施

將成功造模的159只動物隨機分為模型組(5×3只)和治療組(16×3×3只)，治療組按二因素四水平[L16(45)]正交試驗設(shè)計原理分組。治療時間窗為A因素，設(shè)缺血1.0 h、1.5 h、2.0 h和2.5 h 4個水平；治療劑量為B因素，設(shè)5、10、20和40 mg/kg 4個水平。正交試驗重復(fù)3次。

胡黃連苷Ⅱ，純度>98%，分子式：C23H28O13，粉劑由天津奎青醫(yī)藥公司提供，按照大鼠體重秤取相應(yīng)劑量的胡黃連苷Ⅱ粉劑，應(yīng)用等滲鹽水溶解稀釋成1 mL溶液，按照[L16(45)]正交設(shè)計，在相應(yīng)的缺血時間腹腔注射不同濃度的胡黃連苷Ⅱ溶液各1 mL。對照組和模型組與術(shù)后2 h腹腔注射等量等滲鹽水。

3 標本采集

3.1石蠟切片 治療后24 h，隨機取對照組5只、模型組5只和治療組16×3只大鼠，以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟依次灌注生理鹽水200 mL和4%多聚甲醛200 mL，完整取腦，置4%甲醛溶液中固定2 h，蒸餾水浸泡4 h。常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，厚度5 μm，貼于多聚賴氨酸處理的載玻片上，4 ℃保存。

3.2總蛋白提取 治療后24 h，隨機取對照組5只、模型組5只和治療組16×3只大鼠，麻醉后經(jīng)心臟灌注生理鹽水200 mL，開顱取腦，切取缺血腦組織200 mg，迅速置1.5 mL EP管中，按1∶4比例加細胞裂解液(500 μL裂解液+5 μL PMSF，No. P0013，碧云天生物技術(shù)研究所)，超聲波勻漿，4 ℃冷凍離心機(Eppendorf 5801型)10 949×g離心10 min，去沉淀組織留上清液，BCA法測定蛋白濃度，-20 ℃保存。

3.3RNA提取 治療后24 h，隨機取對照組5只、模型組5只和治療組16×3只大鼠，麻醉后經(jīng)心臟灌注生理鹽水200 mL，開顱取腦，切取缺血腦組織200 mg，放入1.5 mL EP管，加1 mL RNA-Solv Reagent，剪碎研磨，超聲振蕩30 s，室溫放置5 min，4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清置另一EP管，加0.2 mL氯仿，蓋緊離心管，振蕩混勻15 s，冰上放置10 min，4 ℃、12 000×g離心15 min；取無色水相置于EP管中，并加入0.5 mL異丙醇，輕輕混勻，冰上放置10 min，4 ℃、12 000×g離心15 min，小心棄上清；加75%乙醇1 mL洗滌沉淀，渦旋混勻，4 ℃、7 500×g離心5 min，小心棄上清；通風櫥干燥15～30 min(沉淀由白色變?yōu)橥该鞣娇?，加0.1% DEPC水30 μL后置于57 ℃水浴中10 min；室溫靜置后，紫外分光光度計(Bekamann DU640)測定RNA純度和豐度，-20 ℃保存。

4 觀察指標

4.1固綠髓鞘染色 切片常規(guī)脫蠟入水，經(jīng)95%乙醇處理1 min后置于固綠乙醇溶液，37 ℃染色1 h，95%乙醇洗10 s×2次，蒸餾水洗15 s×3次，0.3%碳酸鋰分色10 s×2次，蒸餾水洗15 s×3次，核固紅復(fù)染90 s，蒸餾水沖洗后常規(guī)脫水、透明、封固。光鏡下正常髓鞘呈條索狀，深綠色，排列緊密，細胞呈紅色。在400倍光鏡下選取頂葉腦白質(zhì)區(qū)5個不重疊的視野，Quantity One軟件進行灰度分析，取均值。以髓鞘染色灰度值(dyeing gray value，DGV)表示髓鞘變化情況。

4.2免疫組化染色 兔抗鼠MBP Ⅰ抗、鏈霉親和生物素辣根過氧化物酶(SABC)試劑盒、3,3-二氨基聯(lián)苯氨(DAB)顯色試劑盒均由武漢博士德生物公司提供。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，按SABC試劑盒說明書步驟操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，光鏡下觀察髓鞘呈棕黃色條索狀，陽性細胞胞質(zhì)著色不均勻，呈空泡狀。陰性對照切片不加Ⅰ抗以0.01 mol/L PBS替代染色，不出現(xiàn)陽性著色。在400倍光學顯微鏡下隨機觀察大腦缺血腦白質(zhì)區(qū)5個不重疊的視野，Quantity One軟件進行灰度分析，取均值。以髓鞘免疫組化灰度值(immunohistochemical gray value，IGV)表示MBP表達程度。

4.3Western blotting檢測 制備12%分離膠，5%濃縮膠，先后在75 V、120 V電壓下電泳，獲得目的條帶(MBP分子量：18 kD，23 kD)，360 mA轉(zhuǎn)膜40 min，磷酸鹽-吐溫緩沖液(phosphate buffered saline with Tween-10，PBST)洗膜5 min×3次，然后加MBP兔抗大鼠Ⅰ抗(Abcam)孵育2 h，PBST洗滌Ⅰ抗10 min×3次，辣根酶標記山羊抗兔Ⅱ抗(北京中杉金橋)孵育1 h，PBST洗滌5 min×3次，PBS 5 min×3次清洗后顯影。將膜置于A、B混合顯影液中，用Bio-Rad 2000型凝膠成像系統(tǒng)掃描，Quantity One軟件進行灰度分析。以同一標本β-actin(42 kD)的灰度值作為內(nèi)參照，校正目的蛋白灰度值，計算目的蛋白相對值(relative value of protein, RVP)：樣品灰度值/β-actin灰度值。重復(fù)測定3次。

4.4RT-PCR檢測 (1) 引物設(shè)計：應(yīng)用Primer Premier 5.0進行引物設(shè)計(上海英濰捷基有限公司合成)。MBP上游引物5’-CCC ATT GGT GCA CAC TAA CCT-3’，下游引物5’-CGA CTT GAT TCA GCG ACA GGA-3’，片段長度103 bp。內(nèi)參照GAPDH上游引物5’-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CCT C-3’，下游引物5’-TAG GAG CCA GGG CAG TAA TCT-3’，片段長度110 bp。(2) 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA體系25 μL：Oligo(dT) 2 μL，RNA 2 μg，DEPC-H2O補至13.4 μL。混勻后置于70 ℃ 5 min，冰浴5 min后，加入以下物質(zhì)：M-MLV RT 5×5 μL，dNTP Mixture 5 μL，RNase inhibitor 0.62 μL，M-MLV Reverse Transcriptase 1 μL?；靹蚝?2 ℃ 1 h，70 ℃反應(yīng)15 min，-20 ℃保存。(3) PCR體系50 μL：10×PCR buffer 5 μL，dNTP (10 mmol/L) 1 μL，cDNA 1 μL，primer 1 (10 μmol/L) 1 μL，primer 2 (10 μmol/L)1 μL，Taq聚合酶 0.4 μL，0.1% DEPC-H2O補至50 μL。循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,30個循環(huán)，72 ℃ 3 min。(4)電泳：RT-PCR體系50 μL，加6×DNA loading buffer 10 μL 振蕩混勻，離心5 s，上樣10 μL。選取適合的DNA Marker 2 μL上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V、100 mA)30 min，溴化乙啶(EB)染色，凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)檢測各條帶灰度值，以目的基因與內(nèi)參照GAPDH灰度值的比值，表示目的基因的相對豐度(relative content of mRNA，RCM)。重復(fù)測定3次。

5 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。單因素方差分析(One-way ANOVA)進行多組數(shù)據(jù)之間差異的比較，多重比較運用最小顯著差異(least significant difference，LSD)法。根據(jù)不同缺血(給藥)時間和劑量以及缺血時間和劑量的交互作用對實驗檢測指標是否有顯著影響，得出最佳的劑量和時間窗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 檢測結(jié)果

對照組固綠染色髓鞘呈條索狀，深綠色，排列緊密。造模后，髓鞘疏松，染色變淺，膠質(zhì)細胞空泡形成。DGV、IGV、MBP蛋白含量(RVP)和MBP mRNA豐度(RCM)均顯著低于對照組(P<0.05)。經(jīng)胡黃連苷Ⅱ治療后，DGV、IGV、RVP和RCM較模型組均顯著升高(P<0.05),見表1和圖1～4。正交試驗各指標結(jié)果如表2所示，表中所列數(shù)據(jù)均為3次正交試驗的均值，表中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和SS為固綠髓鞘染色MGV方差分析數(shù)據(jù)，其余方差分析指標數(shù)據(jù)從略。

表1 檢測結(jié)果

表2 L16 (45)正交表及檢測結(jié)果

2 結(jié)果分析

2.1固綠髓鞘染色 由圖1和表2可見，自變量因素A(時間)的不同水平對髓鞘損傷有顯著影響(P<0.01)，而因素B(劑量)和因素C (時間-劑量交互作用)無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，即給藥時間對腦缺血后髓鞘損傷程度有顯著的影響，而給藥劑量無顯著影響，時間-劑量交互作用可忽略不計。LSD法對不同水平進行兩兩比較得LSD值，給藥時間各組之間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。給藥劑量5 mg/kg(B1)和10 mg/kg(B2)之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。從治療時間窗最大化和用藥劑量最小化的角度綜合考慮，以A3B2組合最好，即最佳治療時間窗和劑量分別為缺血2.0 h腹腔注射10 mg/kg。

Figure 1. The myelin in parietal white matter of rats (fast green staining,×400).Normal nerve fiber myelin was dark green and cord-like, tightly packed (→), and the nucleus was red (▲). After modeling, myelin fibers were uncolored, loose (white arrows) and vacuolated (★).Mean±SD.n=5.#P<0.05 vs control;*P<0.05 vs model.

2.2免疫組化染色 由圖2和表2可見，自變量因素A(時間)的不同水平對髓鞘表達的影響有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，B(劑量)和時間-劑量交互作用(C)無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，即給藥時間對腦缺血后髓鞘表達有顯著影響，而給藥劑量以及給藥時間和給藥劑量的交互作用可以忽略不計。兩兩比較LSD值顯示，給藥時間1.0 h(A1)和1.5 h(A2)、1.0 h(A1)和2.0 h(A3)、1.5 h(A2)和2.0 h(A3)、1.5 h(A2)和2.5 h(A4)、2.0 h(A3)和2.5 h(A4)之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。給藥劑量均無顯著差異。綜合考慮A3B2組合最好，即最佳治療時間窗和劑量分別為缺血2.0 h和10 mg/kg。

2.3Western blotting定量檢測神經(jīng)細胞MBP表達水平 如圖3和表2所示，各組大鼠有不同數(shù)量的蛋白表達，且治療組表達量顯著高于模型組。方差分析顯示，自變量因素A(時間)的不同水平對MBP蛋白表達的影響均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，B(劑量)和時間-劑量交互作用(C)無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩兩比較LSD值顯示，給藥時間1.0 h(A1)和1.5 h(A2)、1.0 h(A1)和2.0 h(A3)、1.5 h(A2)和2.5 h(A4)、2.0 h(A3)和2.5 h(A4)之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。給藥劑量均無顯著差異。綜合考慮A3B2組合最好，即最佳治療時間窗和劑量分別為缺血2.0 h和10 mg/kg。

Figure 2. The myelin in parietal white matter of the rats (SABC staining,×400).In control group, myelin packed closely and tidy (→). After modeling, myelin became loose and disordered (white arrows), and the positive cells were unevenly colored and vacuolated (▲). Mean±SD.n=5.#P<0.05 vs control;*P<0.05 vs model.

Figure 3. The effects of picroside Ⅱ on the expression of MBP after cerebral ischemia injury.C: control; M: model; 1～4: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 1.0 h; 5～8: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 1.5 h; 9～12: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 2.0 h; 13～16: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 2.5 h; 1, 5, 9 and 13: intraperitoneal injection of 5 mg/kg picroside Ⅱ; 2, 6, 10 and 14: intraperitoneal injection of 10 mg/kg picroside Ⅱ; 3, 7, 11 and 15: intraperitoneal injection of 20 mg/kg picroside Ⅱ; 4, 8, 12 and 16: intraperitoneal injection of 40 mg/kg picroside Ⅱ.Mean±SD.n=3.#P<0.05 vs C;*P<0.05 vs M.

2.4RT-PCR檢測腦組織MBP mRNA水平 如圖4和表2所示，各組大鼠轉(zhuǎn)錄水平不同，治療組大鼠mRNA較模型組升高。方差分析顯示，自變量因素A(時間)的不同水平對MBP mRNA表達的影響均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，B(劑量)和時間-劑量交互作用(C)無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩兩比較LSD值顯示，給藥時間1.0 h(A1)和1.5 h(A2)、1.0 h(A1)和2.0 h(A3)、1.5 h(A2)和2.0 h(A3)、1.5 h(A2)和2.5 h(A4)、2.0 h(A3)和2.5 h(A4)之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，1.0 h(A1)和2.5 h(A4)之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。給藥劑量各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。綜合考慮A2B3組合最好，即最佳治療時間窗和劑量分別為缺血1.5 h和20 mg/kg。

Figure 4. The effects of picroside Ⅱ on the mRNA expression of MBP after cerebral ischemia injury.C: control; M: model; 1～4: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 1.0 h; 5～8: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 1.5 h; 9～12: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 2.0 h; 13～16: intraperitoneal injection of picroside Ⅱ at ischemia 2.5 h; 1, 5, 9 and 13: intraperitoneal injection of 5 mg/kg picroside Ⅱ; 2, 6, 10 and 14: intraperitoneal injection of 10 mg/kg picroside Ⅱ; 3, 7, 11 and 15: intraperitoneal injection of 20 mg/kg picroside Ⅱ; 4, 8, 12 and 16: intraperitoneal injection of 40 mg/kg picroside Ⅱ.Mean±SD.n=3.#P<0.05 vs C;*P<0.05 vs M.

討 論

正交表能夠在因素變化范圍內(nèi)均衡抽樣，在減少實驗次數(shù)的同時，使每次實驗都具有較強的代表性，是一種高效、經(jīng)濟的實驗方法[17]。本實驗應(yīng)用正交表對實驗進行整體設(shè)計、綜合比較、統(tǒng)計分析，實現(xiàn)通過少數(shù)的實驗次數(shù)找到較好的治療方案，以達到最佳的治療效果。

MBP有中樞性MBP和周圍性MBP兩種，腦白質(zhì)中含量最高，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中由少突膠質(zhì)細胞合成，是一種堿性的、不含糖和脂質(zhì)的膜蛋白。神經(jīng)纖維必須經(jīng)過髓鞘化才能發(fā)揮傳導(dǎo)功能，而MBP是參與髓鞘合成的一種非常重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在神經(jīng)纖維中起絕緣和快速傳導(dǎo)作用，對于神經(jīng)系統(tǒng)功能的發(fā)揮扮演著重要的角色。人和鼠MBP基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稍有不同，鼠腦中至少有21.5 kD、18.5 kD、17 a、17 b和14 kD 5種產(chǎn)物，而人有21.5 kD、20.2 kD、18.5 kD和17.3 kD 4種，其中18.5 kD MBP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘成熟期的主要蛋白。正常情況腦脊液中MBP含量小于6.95 mg/L，缺血性腦損傷發(fā)生時由于腦組織缺血缺氧導(dǎo)致少突膠質(zhì)細胞死亡，髓鞘脫失，使MBP流向腦脊液中，再加上腦損傷本身導(dǎo)致血腦屏障的破壞，使漏入腦脊液中的MBP進入血液，因此，血清MBP的測定能夠在一定程度上反映是否發(fā)生腦組織損傷，成為判定有無髓鞘脫失的一種特異性蛋白標記物[18-20]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，在腦缺血損傷早期MBP mRNA及蛋白表達都降低，尤其在腦缺血損傷的前24 h，MBP蛋白降低顯著[21]。實驗發(fā)現(xiàn)[4, 22-23]，MBP對于預(yù)測腦損傷程度、判斷預(yù)后等方面都具有顯著作用。因此，本實驗也檢測了MBP mRNA及蛋白的表達，以確定腦損傷程度。MBP表達增加能起到腦保護作用[24]。本實驗顯示，腦缺血損傷后MBP mRNA及蛋白的表達顯著降低，固綠染色表明髓鞘纖維同步減少，損傷的陽性細胞顯著升高，因此證實，從各個水平檢驗MBP都可作為檢測腦損傷，以及髓鞘損傷的生物學指標。

傳統(tǒng)中藥的優(yōu)勢已得到證實[25]，胡黃連具有清熱燥濕、消痞退蒸、涼血利膽等作用[26]，且胡黃連苷Ⅱ是其有效成分之一。細胞實驗發(fā)現(xiàn)，胡黃連苷Ⅱ有較強的抗氧化作用[27]，能減輕H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞損傷，提高細胞存活率[28]。前期我們也做了大量的動物實驗證實，胡黃連苷Ⅱ能夠抑制炎癥細胞因子Toll樣受體4、核因子κB、caspase-3以及腫瘤壞死因子α等的表達，抑制大鼠大腦中動脈閉塞再灌注后缺血半影區(qū)相關(guān)炎癥因子的表達，進而抑制缺血損傷導(dǎo)致的腦細胞凋亡[29-33]。本次實驗結(jié)果表明，胡黃連苷Ⅱ治療組較模型組，髓鞘排列有序，空泡細胞減少，MBP蛋白表達以及mRNA反轉(zhuǎn)錄水平都有不同程度的升高，從不同的水平證明了胡黃連苷Ⅱ的抗腦缺血損傷的神經(jīng)保護作用。進一步的時間劑量優(yōu)化表明，在缺血1.5～2.0 h給予胡黃連苷Ⅱ10～20 mg/kg，抗腦損傷作用顯著。

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