戴 輝， 宋向群， 潘星辰， 彭海燕， 韋 江， 周韶璋△

(廣西醫(yī)科大學 1研究生院， 2附屬腫瘤醫(yī)院化療二科，廣西 南寧 530021)

分子靶向藥物在基因指導下的個體化治療已成為當今非小細胞肺癌治療的共識。棘皮動物微管結(jié)合蛋白樣蛋白4-間變性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK)融合基因是近期發(fā)現(xiàn)的非小細胞肺癌新的分子亞型,其突變與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)及Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS)突變是不共存的[1]，所以其信號通路的靶點研究臨床意義極大。人們研究發(fā)現(xiàn)，ALK包含許多重要的生物學信號通路，影響著腫瘤細胞增殖、分化與凋亡?？诉蛱婺?crizotinib)是近來發(fā)現(xiàn)針對ALK靶點的小分子抑制劑，它可以抑制ALK磷酸化及抑制細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，從而導致細胞分裂停止于G1/S期。本研究針對含有EML4-ALK融合基因的人非小細胞肺癌細胞株H2228，用crizotinib處理后，觀察ALK下游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路的變化，以探討mTOR信號通路在crizotinib誘導的人非小細胞肺癌細胞株H2228細胞凋亡中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞 人非小細胞肺癌細胞H2228由廣東省肺癌研究所贈送，人非小細胞肺癌細胞A549細胞由廣西醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)學院實驗部提供。

1.2主要試劑與儀器 Crizotinib粉末制劑購于Selleckchem， RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone，胎牛血清和胰蛋白酶替代物購自Gibco，MTT購自Amresco，總RNA小量制備試劑盒購自Axygen康寧生命科學有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa寶生物工程(大連)公司，定量PCR試劑盒購自Roche，RNase-free water購自生工生物工程有限公司，GoldView I型核酸染色劑購自上海索萊寶生物科技有限公司，電泳儀購自北京六一儀器廠(型號為JY-ECPT3000)，凝膠成像儀購自Bio-Rad,型號為170-8170，Western blotting儀器設備購于Bio-Rad，ALK Ⅰ抗、p-ALKⅠ抗、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)Ⅰ抗、p-PI3KⅠ抗、AKTⅠ抗、p-AKTⅠ抗、mTORⅠ抗、p-mTORⅠ抗、70 kD核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase, 70-kD, p70S6K)Ⅰ抗、p-p70S6KⅠ抗和熒光Ⅱ抗均購自Cell Signaling，BCA試劑盒購自Merck，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒購自BD。

2 方法

2.1檢測H2228細胞與A549細胞EML4-ALK融合基因 培養(yǎng)H2228細胞與A549細胞到細胞狀態(tài)穩(wěn)定后，按總RNA小量制備試劑盒說明提取細胞總RNA，用2%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)檢測所得總RNA的完整性，用微量分光光度計測定總RNA濃度，EML4-ALK上、下游引物序列分別為：5’-ATCACTGTGCTAAAGGCGGCTT-3’和5’ -GAGCTTGCTCAGCTTGTACTCA-3’。按定量PCR試劑盒說明書進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物送華大生物科技有限公司進行基因測序。

2.2MTT法檢測細胞增殖率 按照腫瘤貼壁細胞常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)H2228細胞和A549細胞至對數(shù)生長期，按(6～10)×103cells/well的細胞密度接種于96孔板，預設置6個濃度，每個濃度設置4個復孔，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按濃度梯度加入藥物，把細胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，吸凈孔內(nèi)液體，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后再加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，充分振蕩10 min，在492 nm波長下測量吸光度，分別計算出crizotinib對H2228細胞和A549細胞的IC50，實驗重復3次。

2.3流式細胞術檢測細胞凋亡和周期分布情況 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期H2228細胞與A549細胞，以4×105、5×105和7×105cells/well的細胞數(shù)量分別接種于6孔板中(2種細胞各接種8個孔)，培養(yǎng)24 h，加入crizotinib濃度為300 nmol/L的血清培養(yǎng)液，將按4×105cells/well接種的細胞培養(yǎng)72 h，按5×105cells/well接種的細胞培養(yǎng)48 h，按7×105cells/well接種的細胞培養(yǎng)24 h，以細胞凋亡試劑盒和周期試劑盒說明書收集細胞并染色后用流式細胞術測定細胞凋亡率和周期分布，實驗重復4次。

2.4Western blotting檢測crizotinib對ALK/PI3K/AKT/mTOR信號通路相關信號蛋白表達的影響 收集長滿瓶的H2228細胞和A549細胞，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，所得總蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上，ALKⅠ抗稀釋度1∶1 000，p-ALKⅠ抗稀釋度1∶1 500，PI3KⅠ抗稀釋度1∶1 000，p-PI3KⅠ抗稀釋度1∶1 500，AKTⅠ抗稀釋度1∶2 000，p-AKTⅠ抗稀釋度1∶1 500，mTORⅠ抗稀釋度1∶1 000，p-mTOR稀釋度1∶1 500，p70S6K稀釋度1∶1 000，p-p70S6K稀釋度1∶1 500，兔、鼠Ⅱ抗稀釋度1∶15 000，以β-肌動蛋白(β-actin)作內(nèi)參照，紅外熒光Ⅱ抗(DyLight 680 conjugate)顯色，掃描分析條帶，以條帶灰度確定蛋白表達，實驗重復3次。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 H2228細胞與A549細胞的EML4-ALK基因測序結(jié)果

H2228細胞和A549細胞分別提取mRNA，提取產(chǎn)物通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴增后電泳，發(fā)現(xiàn)在633 bp的位置有亮帶即EML4-ALK的位置，測序得出H2228細胞包含的EML4-ALK融合基因是變異體3(variant 3, V3)而且檢測到a亞型和b亞型。A549細胞由于不含有該融合基因故無法通過RT-PCR擴增出目的DNA，見圖1。

Figure 1. The DNA sequencing result of H2228 cells.The sequence in red box is the extra sequence of V3b compared with V3a.

2 MTT比色法檢測crizotinib對H2228細胞和A549細胞株生長的影響

MTT實驗計算得出H2228細胞的IC50為334.51 nmol/L。A549細胞對crizotinib的處理不敏感，給予10倍于H2228細胞的IC50后抑制率未及36%，見表1。

3 流式細胞術檢測細胞凋亡及周期分布

根據(jù)MTT所得H2228細胞的IC50，以300 nmol/L作為實驗的藥物濃度，在光鏡下觀察經(jīng)藥物處理后細胞形態(tài)學變化(見圖2)。3組細胞未經(jīng)過處理時凋亡率無顯著差異(P>0.05)，經(jīng)crizotinib處理的H2228細胞24 h、48 h和72 h凋亡率較A549組和未加藥處理組明顯增加(P<0.05)，且隨時間延長凋亡率增大，見圖3。經(jīng)藥物處理的H2228細胞G2/G1：(96.26±0.80)%/(1.55±0.57)%，未經(jīng)過藥物處理的H2228細胞G2/G1：(14.49±2.16)%/(70.22±2.77)%，藥物處理使細胞明顯抑制在G1期，見圖4。

表1 細胞抑制率

Figure 2. Morphological changes of H2228 cells treated by crizotinib.The number of apoptotic cells was increased with the time of crizotinib treatment; even a blank area can be found after crizotinib treated for 72 h (the red circle).

Figure 3. Apoptotic rates of H2228 and A549 cells after treated with 300 nmol/L crizotinib at different time points.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs other groups.

Figure 4. Cell cycle distribution of H2228 cells after treaded with (A) or without (B) 300 nmol/L crizotinib for 72 h.

4 Western blotting檢測crizotinib對mTOR信號通路相關信號蛋白表達的影響

300 nmol/L crizotinib處理EML4-ALK陽性肺癌細胞株H2228 72 h發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇激酶相關激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinases，PIKKs)蛋白家族成員中p-mTOR分子表達降低，其上游信號p-AKT、p-PI3K、p-ALK及下游信號分子p-p70S6K表達均降低，而在相對不敏感的EML4-ALK陰性細胞株A549中表達變化不明顯，見圖5。

Figure 5. Western blotting results of the protein expression levels in H2228 and A549 cells after treated with 300 nmol/L crizotinib for 72 h.

討 論

mTOR是PIKKs蛋白家族成員，可通過多條信號通路實現(xiàn)對細胞生長的調(diào)節(jié)作用，一條是生長因子激活通路經(jīng)PI3K/AKT途徑，另一條是細胞外氨基酸通路，再一條是經(jīng)肝激酶 B1(liver kinase B1，LKB1)/AMP激活蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]途徑。有研究顯示PI3K/AKT/mTOR信號通路的活化與多種腫瘤發(fā)生密切相關，它能夠加速細胞復制周期、減少細胞凋亡，并促進腫瘤細胞的遷移，在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2-4]，也有文獻證實PI3K可以被ALK信號所激活[5-7]，但具體機制尚未完明闡明。Crizotinib為針對ALK/c-Met雙靶點的小分子酪氨酸激酶抑制劑，進入胞漿后與位于細胞膜內(nèi)側(cè)的酪氨酸激酶ATP結(jié)合域相結(jié)合，通過阻斷該通路的信號傳導來實現(xiàn)細胞的生長抑制和促進凋亡[8]，然而crizotinib誘導細胞凋亡的機制復雜,許多環(huán)節(jié)仍不清楚,有待進一步研究。

我們的研究發(fā)現(xiàn)H2228細胞中含有EML4-ALK融合基因V3，且發(fā)現(xiàn)V3有2個亞型V3a和V3b，這與Martelli等[9]的研究結(jié)果相一致，該研究發(fā)現(xiàn)V3b比V3a多出的33 bp是來自于EML4的內(nèi)含子6，本實驗結(jié)果中也得到證實，但是否不同的亞型存在其它方面的差異仍需要進一步實驗求證。在使用crizotinib作用EML4-ALK陽性細胞株H2228時, 其凋亡細胞百分率在早期即與對照細胞株A549有明顯差異，且隨著培養(yǎng)時間延長和濃度的增加而增大，crizotinib處理的H2228細胞各時點和各濃度值凋亡細胞比例均大于壞死細胞，呈時間依賴性和濃度依賴性，在用crizotinib處理細胞后細胞的凋亡率顯著增加并且檢測出mTOR蛋白的活化形式p-mTOR水平降低，推測mTOR在調(diào)控腫瘤細胞的生長方面有重要作用。目前認為，在含有EML4-ALK融合基因的腫瘤細胞中持續(xù)活化的ALK通過依次磷酸化其底物蛋白，以聚集PI3K的p85亞基，并將信號傳遞給p110亞基，導致PI3K的激活；活化的PI3K 催化磷脂酰肌醇P2(phosphatidylinositol P2，PtdIinsP2)變成PtdIinsP3,兩者仍留在膜上,可以募集下游分子AKT到細胞膜上，PtdIinsP3可激活磷脂酰肌醇依賴性激酶1,后者可使AKT激活, 活化AKT的可直接激活mTOR,也可通過抑制結(jié)節(jié)性硬化復合物2(tuberous sclerosis complex 2，TSC2)與TSC1 形成復合物來激活mTOR信號，活化的mTOR可以磷酸化并激活P70S6K，使核糖體40S小亞基易于結(jié)合翻譯復合物，并提高5’-mTOR mRNA的翻譯效率[10]。為進一步闡明mTOR在crizotinib誘導的EML4-ALK陽性細胞凋亡中的分子機制，我們采用Western blotting法對PI3K/AKT/mTOR信號通路進行檢測，實驗結(jié)果顯示H2228細胞在crizotinib的作用下EML4-ALK V3融合蛋白的表達量未受影響，但其活化形式p-ALK明顯受到抑制，這與Kim等[11]的研究結(jié)果相一致。Crizotinib靶向作用于ALK蛋白，抑制其酪氨酸激酶域的磷酸化，使其不能活化[12]，而且下游信號蛋白PI3K、AKT和mTOR的活化形式p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表達水平都受到抑制，這與Tanizaki等[13]的實驗結(jié)果中所示的p-AKT不受ALK抑制劑的影響不符，而與Kim等[11]的研究結(jié)果相同。在不含有EML4-ALK的A549細胞中由于不含有EML4-ALK融合蛋白，未見ALK蛋白的表達，這與Katayama等[14]的實驗結(jié)果相一致；而且在A549細胞中未見到p-AKT和p-mTOR蛋白的表達水平受crizotinib的影響而下降，提示在含有EML4-ALK融合基因的H2228細胞中PI3K/AKT/mTOR通路的激活與ALK的活化密切相關[15-17]。在crizotinib處理的H2228細胞中mTOR下游蛋白p70S6K的活化形式p-p70S6K蛋白水平也降低，提示mTOR可能是通過下游蛋白p70S6K對細胞的生長進行調(diào)控；而在A549細胞中雖然p-mTOR水平很高，但下游蛋白p70S6K的活化水平卻很低，提示在A549細胞中mTOR可能是通過細胞外氨基酸通路,或者是經(jīng)LKB1/AMPK途徑對細胞的生長進行調(diào)控[10]，但還需要進一步實驗去證實。同時在對經(jīng)過crizotinib處理的H2228細胞進行細胞周期檢測時發(fā)現(xiàn)大量細胞停留在G1期，與Tumati等[18]所得研究結(jié)果一致。由于mTOR信號通路在調(diào)節(jié)細胞周期方面有關鍵作用[19-20]，提示mTOR信號通路可能在G1/S期轉(zhuǎn)換過程中起重要作用。

本研究表明了PIKK蛋白家族成員mTOR在crizotinib誘導的EML4-ALK陽性細胞株H2228凋亡中發(fā)揮了重要作用。由于crizotinib等酪氨酸激酶抑制劑類藥物作用于靶細胞后，通常會引發(fā)多通路、多分子的后繼變化，通過對其誘導細胞凋亡的分子機制研究，有助于遴選關鍵分子，采用有效的刺激誘導上調(diào)腫瘤細胞中相關促凋亡分子的表達水平或聯(lián)合“沉默”降低相關抗凋亡分子的表達，為肺癌治療探索的新方法，也為今后深入研究靶向耐藥機制提供分子生物學基礎。本實驗仍有一些不足,在以后的研究中可以進一步追進，如可以對mTOR信號通路關鍵基因進行敲除，培養(yǎng)敲除關鍵基因后的細胞，檢測mTOR信號通路上各關鍵蛋白的表達水平和活化水平，進一步明確通路上各蛋白之間的關系，敲除關鍵基因的細胞用同樣條件的藥物處理，檢測此時的IC50和流式細胞周期和凋亡率是否發(fā)生變化，進一步闡明mTOR信號通路在H2228細胞凋亡中所起的作用。

[參 考 文 獻]

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