葉志強， 范 瑾， 楊躍武， 劉旭輝， 趙 坤， 潘衛(wèi)東△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1急診科， 3中醫(yī)科， 4肝膽外科， 廣東 廣州 510630；2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510632)

蛋白激酶Cε(protein kinase Cε, PKCε)是蛋白激酶C[1]的一個重要亞型，是蛋白激酶C家族中與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系比較密切的蛋白[2]，一般認(rèn)為其可能通過蛋白激酶B (protein kinase B，Akt)[3]、轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)[4]、WNT(wingless type MMTV integration site family)[5]等信號通路影響腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲等生物學(xué)過程，有望成為多種惡性腫瘤的治療靶點[6]。人肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的四大惡性腫瘤之一，目前尚缺乏效果滿意的基因治療手段[7]。目前已經(jīng)有很多抑制PKCε表達對其它惡性腫瘤具有明顯抑制作用的報道，但PKCε與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展之間關(guān)系的研究較少，并且其影響肝癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的分子機制尚未完全明確。本研究采用針對PKCε的小干擾RNA(PKCε-siRNA)轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌SK-Hep-1細(xì)胞，觀察其對PKCε基因的沉默作用，及其對肝癌細(xì)胞生長增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響[8]，并進一步明確其分子生物學(xué)機制，為肝癌的基因治療提供新的靶點和策略。

材 料 和 方 法

1 材料

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine se-rum, FBS)、胰酶、PBS和Trizol購自Invitrogen；real-time PCR試劑盒購自TaKaRa，引物采用Primer 3軟件設(shè)計，由Invitrogen合成。兔抗人PKCε抗體和β-actin抗體購自BD。報告基因質(zhì)粒(pKF-κB-Luc)和內(nèi)參照質(zhì)粒(pRL-SV40)購自廣州愛科生物技術(shù)有限公司。Annexin V-PI雙染試劑盒和Dual-luciferaseTMReporter Gene Assay試劑盒購自碧云天生物科技研究所。人肝癌細(xì)胞株SK-Hep-1購自復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所。PKCε小干擾RNA(PKCε-siRNA)和陰性對照siRNA(NC-siRNA)購自Santa Cruz。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇培養(yǎng)SK-Hep-1肝癌細(xì)胞株用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于6孔板中，培養(yǎng)條件為飽和濕度、5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。細(xì)胞融合度達70%時，采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PKCε-siRNA和NC-siRNA，按照試劑說明書轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，進行后續(xù)檢測。同時設(shè)立空白對照(control)組。

2.2實時熒光定量PCR檢測mRNA表達 Trizol法提取各組總細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PKCε上游引物5’-ATGGTAGTGTTCAATGGCCTTCT-3’，下游引物5’-TCAGGGCATCAGGTCTTCAC-3’；內(nèi)參照β-actin上游引物5’-TCATGAAGTGTGACGTGGACAT-3’，下游引物5’-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3’。PCR反應(yīng)條件為94 ℃、30 s；94 ℃、5 s；58 ℃、30 s；50個循環(huán)，循環(huán)延伸末端收集熒光信號。Real-time PCR數(shù)值分析采用2-ΔΔCt分析法。

2.3Western blotting法檢測蛋白表達 siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，提取蛋白，按照常規(guī)方法進行Western blotting[9]，分析PKCε、細(xì)胞核增殖抗原Ki-67、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)和β-肌動蛋白(β-actin)蛋白的表達。

2.4四甲基偶氮唑鹽法檢測肝癌細(xì)胞增殖能力 各實驗組以2×104cells/well重懸于200 μL培養(yǎng)基中，接種于96孔板，每個實驗組3個復(fù)孔。分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h后行MTT檢測。每孔加入20 μL 0.5% MTT溶液。在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO液，常溫緩慢振蕩0.5 h使溶解反應(yīng)完全[10]。酶標(biāo)儀測490 mn處吸光度(A)，如下公式計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=A轉(zhuǎn)染組/A對照組×100%。

2.5Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力 將Matrigel 1∶3稀釋后，每個Transwell小室加入60 μL，37 ℃孵育2 h使其凝固后棄去多余液體。分組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞同前接種入Transwell小室上室，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h、48 h后取出小室，棉簽擦去未過膜細(xì)胞，多聚甲醛固定后行Giemsa染色[11]。醋酸溶解上室底膜，分光光度計檢測570 nm處A值。

2.6螢光素酶報告基因?qū)嶒?各實驗組細(xì)胞鋪24孔板，進行pKF-κB-Luc質(zhì)粒和pRL-SV40質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，裂解細(xì)胞，采用Dual-luciferaseTMReporter Gene Assay 試劑盒處理后，于多功能酶標(biāo)儀中按照Gen5軟件步驟進行檢測。取螢光素酶活性值與內(nèi)參螢光素酶活性值的比值為螢光素酶相對活性。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，2組之間比較采用t檢驗。以P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 siRNA干擾對SK-Hep-1細(xì)胞PKCε mRNA表達的影響

PKCε-siRNA組 PKCε mRNA表達量為對照組的12.1%，即干擾效率達到87.9%。而NC-siRNA組與對照組之間PKCε mRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。這說明siRNA沉默PKCε基因的效果明顯。

Figure 1. Effects of PKCε-siRNA on expression of PKCε mRNA in SK-Hep-1 cells detected by real-time PCR.Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control.

2 siRNA干擾對蛋白表達的影響

實驗組PKCε、Ki-67和MMP-9蛋白的表達量明顯降低，而NC-siRNA組與對照組之間的蛋白表達無明顯差異，見圖2。Western blotting結(jié)果與real-time PCR結(jié)果一致，說明siRNA抑制PKCε蛋白表達的效果明顯，且同時對Ki-67和MMP-9蛋白的表達產(chǎn)生了影響。

Figure 2. Effects of PKCε-siRNA on protein expression of PKCε, Ki-67 and MMP-9 in SK-Hep-1 cells. Mean±SD. n=6.**P<0.01 vs control.

3 siRNA干擾對增殖能力的影響

轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h后，對照組和NC-siRNA組的生長未受到明顯抑制，而PKCε-siRNA組細(xì)胞的生長在轉(zhuǎn)染24 h后即出現(xiàn)抑制作用，到72 h時抑制作用最大，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。轉(zhuǎn)染PKCε-siRNA 24 h、48 h和72 h后增殖率分別為78.79%、69.64%和55.66%，說明PKCε-siRNA對肝癌細(xì)胞的生長產(chǎn)生了明顯的抑制作用。

Figure 3. Effects of PKCε-siRNA on SK-Hep-1 cell growth.Mean±SD. n=6.**P<0.01 vs control.

4 siRNA對細(xì)胞侵襲能力的影響

培養(yǎng)24和48 h后，發(fā)現(xiàn)實驗組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組(P<0.01)，而NC-siRNA組與對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

Figure 4. Effects of PKCε-siRNA on SK-Hep-1 cell invasion. Mean±SD. n=6.**P<0.01 vs control.

5 siRNA干擾對NF-κB通路活性的影響

如圖5所示，螢光素酶報告基因?qū)嶒灁?shù)據(jù)顯示，PKCε表達的變化明顯抑制NF-κB通路的轉(zhuǎn)錄活性，相對于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而NC-siRNA組相對于對照組，NF-κB通路的轉(zhuǎn)錄活性沒有明顯差異。

Figure 5. Effects of PKCε-siRNA on the luciferase activity of NF-κB reporter. Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs control.

討 論

RNA干擾是由siRNA介導(dǎo)的高效基因沉默技術(shù)。在細(xì)胞內(nèi)，RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體結(jié)合siRNA，可發(fā)揮特異性降解靶基因的作用[12]。在本研究中，siRNA通過降低PKCε mRNA和蛋白的表達，有效發(fā)揮了抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進凋亡、減少侵襲的作用。

我們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，將合成的PKCε-siRNA通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SK-Hep-1人肝癌細(xì)胞后，real-time PCR法檢測其mRNA的表達水平，Wes-tern blotting法檢測其蛋白表達水平，結(jié)果顯示PKCε-siRNA能有效降解SK-Hep-1細(xì)胞中的PKCε mRNA，使PKCε蛋白表達明顯下調(diào)。利用RNA干擾技術(shù)降低SK-Hep-1細(xì)胞中的PKCε蛋白表達的效果是明顯的。

我們進一步利用MTT法檢測了沉默PKCε表達后SK-Hep-1細(xì)胞的增殖能力[13]。結(jié)果顯示細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后增殖率就受到明顯抑制，一直到轉(zhuǎn)染后72 h，增殖能力降低到55.66%，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義。進一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后Ki-67蛋白表達水平降低，說明PKCε-siRNA可能通過降低Ki-67的表達改變了細(xì)胞的增殖狀態(tài)，抑制了肝癌細(xì)胞的增殖。

我們采用Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力，驗證了PKCε蛋白與SK-Hep-1細(xì)胞侵襲能力的相關(guān)性[14]。結(jié)果顯示RNA干擾后能通過凝膠的細(xì)胞數(shù)目明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。腫瘤細(xì)胞的侵襲能力較2個對照組均明顯下降，提示腫瘤的侵襲能力隨著PKCε蛋白表達的降低而受限[15]。我們進一步對細(xì)胞侵襲能力變化的分子機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)PKCε-siRNA的抗侵襲作用可能是通過下調(diào)PKCε蛋白，進而降低MMP-9的表達實現(xiàn)的。

Ki-67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原,其功能與有絲分裂密切相關(guān),其表達水平一般與腫瘤細(xì)胞的增殖呈正相關(guān)[16]。MMP-9的表達對腫瘤實現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成具有重要作用[17]，它最主要的功能是降解基質(zhì)，為內(nèi)皮細(xì)胞移行創(chuàng)造必要條件。已有相關(guān)研究證實，在肝癌等惡性腫瘤中，可通過對NF-κB信號通路的抑制，降低Ki-67[18]、MMP-9[19]等蛋白表達，進而抑制其增殖、轉(zhuǎn)移活動[20]。本研究的結(jié)果顯示，PKCε-siRNA降低SK-Hep-1細(xì)胞中的PKCε蛋白表達后，可能通過影響NF-κB信號通路的轉(zhuǎn)錄活性，進而選擇性影響了Ki-67蛋白和MMP-9蛋白的表達，從而抑制了細(xì)胞的增殖和侵襲能力。這可能是PKCε-siRNA抑制PKCε蛋白表達后，影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的主要分子機制。

SK-Hep-1細(xì)胞為典型的人肝癌細(xì)胞株，在抑制PKCε蛋白表達后，通過干預(yù)NF-κB信號通路，其增殖和侵襲能力發(fā)生明顯下降，提示PKCε為可能的致癌因子，有望成為肝癌新的基因治療靶點。

[參 考 文 獻]

[1] Hu CT, Cheng CC, Pan SM, et al. PKC mediates fluctuant ERK-paxillin signaling for hepatocyte growth factor-induced migration of hepatoma cell HepG2[J].Cell Signal,2013,25(6):1457-1467.

[2] Jain K, Basu A. The multifunctional protein kinase C-ε in cancer development and progression[J]. Cancer,2014,6(2):860-878.

[3] Jain K, Basu A. Protein kinase C-ε promotes EMT in breast cancer[J]. Breast Cancer (Auckl),2014,8:61-67.

[4] Xie X, Piao L, Cavey GS, et al. Phosphorylation of Nanog is essential to regulate Bmi1 and promote tumorigenesis[J]. Oncogene,2014，33(16):2040-2052.

[5] Lutzny G, Kocher T, Schmidt-Supprian M, et al. Protein kinase C-β-dependent activation of NF-κB in stromal cells is indispensable for the survival of chronic lymphocytic leukemia B cellsinvivo[J]. Cancer Cell,2013,23(1):77-92.

[6] K?rner C, Keklikoglou I, Bender C, et al. MicroRNA-31 sensitizes human breast cells to apoptosis by direct targeting of protein kinase C(PKC)[J]. J Biol Chem,2013,288(12):8750-8761.

[7] 劉 娟，殷 飛，姚樹坤. 細(xì)胞周期素D1、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤樣蛋白2及微小染色體維持蛋白7在肝細(xì)胞癌中的表達及對預(yù)后的意義[J]. 中國病理生理雜志,2011,27(2):304-309.

[8] 肖 海，賀興波，黃才斌，等. 靶向泛素連接酶 SIAH2 的 shRNA 對人肝癌細(xì)胞株 HepG2 細(xì)胞周期和凋亡的影響'[J]. 中國病理生理雜志,2013,29(8):1406-1411.

[9] Guo Y, Chen W, Wang W, et al. Simultaneous diagnosis and gene therapy of immuno-rejection in rat allogeneic heart transplantation model using a T-cell-targeted theranostic nanosystem[J]. ACS Nano,2012,6(12):10646-10657.

[10] Ye X, Guo Y, Zhang Q, et al. βKlotho suppresses tumor growth in hepatocellular carcinoma by regulating Akt/GSK-3β/cyclin D1 signaling pathway[J].PLoS One,2013,8(1):e55615.

[11] Guo Y, Liang X, Lu M, et al. Mammalian target of rapamycin as a novel target in the treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Hepatogastroenterology,2010,57(101):913-918.

[12] Dudek H, Wong DH, Arvan R, et al. Knockdown of β-catenin with dicer-substrate siRNAs reduces liver tumor burdeninvivo[J]. Mol Ther,2014,22(1):92-101.

[13] 嵇曉輝，范秉琳，張紅鴿，等. MicroRNA-100 對肝癌細(xì)胞增殖活力和細(xì)胞周期的影響[J]. 中國病理生理雜志,2013,29(1):108-111.

[14] 張承彥，謝 鑫，張春喜，等. 糖蛋白非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤蛋白 B 對人肝癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響及其分子機制[J]. 中國病理生理雜志,2013,29(8):1441-1446.

[15] Bordeleau F, Galarneau L, Gilbert S, et al. Keratin 8/18 modulation of protein kinase C-mediated integrin-dependent adhesion and migration of liver epithelial cells[J]. Mol Biol Cell,2010,21(10):1698-1713.

[16] 闞和平，譚永法，周 杰. 索拉非尼治療肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的療效與腫瘤組織 Ki-67 表達及微血管密度的關(guān)系[J]. 中國病理生理雜志,2011,27(8):1549-1551.

[17] 周曉燕，王紅梅，蔡震宇，等. 脂氧素 A4 對肝細(xì)胞生長因子誘導(dǎo) HepG2 肝癌細(xì)胞血管生成相關(guān)細(xì)胞因子表達的影響[J]. 中國病理生理雜志,2011,27(2):300-303.

[18] Wang L, Zhu R, Huang Z, et al. Lipopolysaccharide-induced Toll-like receptor 4 signaling in cancer cells promotes cell survival and proliferation in hepatocellular carcinoma[J].Dig Dis Sci,2013,58(8):2223-2236.

[19] Zhang J, Zhang DL, Jiao XL, et al. S100A4 regulates migration and invasion in hepatocellular carcinoma HepG2 cells via NF-κB-dependent MMP-9 signal[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci,2013,17(17):2372-2382.

[20] Gong Y, Wang L, Wang H, et al. The expression of NF-κB, Ki-67 and MMP-9 in CCOT, DGCT and GCOC[J].Oral Oncol,2009,45(6):515-520.