宋德偉，董曉杰,2，徐 蓓，武利慶，黃 挺，李紅梅

(1. 中國計(jì)量科學(xué)研究院, 北京 100013；2. 中國疾病預(yù)防控制中心，北京 102206)

C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)是人類急性時(shí)相蛋白，目前已成為醫(yī)院的常規(guī)檢測項(xiàng)目，可以在很多疾病診斷上作為輔助判斷的依據(jù)[1-3]。越來越多的證據(jù)表明，CRP不僅是炎癥標(biāo)志物，同時(shí)本身也直接參與炎癥過程[4-6]。在臨床應(yīng)用方面，C-反應(yīng)蛋白的水平檢測在世界范圍內(nèi)越來越受到重視。但是由于免疫分析試劑具有多種產(chǎn)品，各廠家針對不同的目標(biāo)物開發(fā)試劑和方法等因素，造成測量的偏差很大[7]。

目前，國內(nèi)外臨床實(shí)驗(yàn)室CRP的檢測數(shù)據(jù)普遍具有較大偏差，沒有可比性，因此使心肌梗死等疾病的臨床診斷有時(shí)出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果[8-10]。為了使臨床的檢測結(jié)果具有統(tǒng)一的參考值和更規(guī)范的可比性，國際臨床化學(xué)會(huì)和美國臨床化學(xué)會(huì)設(shè)立了CRP標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)，以開展相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化工作[11]。歐美等發(fā)達(dá)國家已經(jīng)著手進(jìn)行CRP的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究。目前世界上有兩種2級(jí)參比物質(zhì)：1)具有世界衛(wèi)生組織第一國際標(biāo)準(zhǔn)CRP (WHO IS 85/506)，濃度100 mg/L[12]；2)具有歐共體標(biāo)準(zhǔn)授權(quán)的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)CRP470[13]。

本次比對是基于中、日、韓國家計(jì)量組織合作框架下，并于2011年9月在中國成都的中日韓會(huì)議上提出并確認(rèn)。由日本計(jì)量院負(fù)責(zé)提供比對樣品，由比對參加單位自由選擇方法。

同位素稀釋質(zhì)譜法(IDMS)具有絕對測量的性質(zhì)、靈敏度高、測量動(dòng)態(tài)范圍寬且測量值溯源到國際基本單位制等優(yōu)點(diǎn)，近年來被國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室廣泛用作蛋白準(zhǔn)確定量的方法，也是目前公認(rèn)的蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的基準(zhǔn)方法。在本次比對中，中國計(jì)量院采用同位素稀釋質(zhì)譜法作為CRP的定值方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 6410 QQQ 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；MS2型漩渦混合器：德國IKA公司產(chǎn)品；Mlnl-6K型掌上離心機(jī)：中國珠海黑馬公司產(chǎn)品；UFE500烘箱：德國Memmert公司產(chǎn)品；3K15型臺(tái)式離心機(jī)：德國Sigma公司產(chǎn)品；移液器(10、20、100、200、1 000 μL)：法國Gilson公司產(chǎn)品；ME235S型天平(感量0.01 mg)：德國Satorius公司產(chǎn)品；UMX2型天平(感量0.1 μg)：瑞典Mettler Toledo公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

甲醇、乙腈(色譜純)：德國Merck公司產(chǎn)品；甲酸(分析純)、鹽酸(優(yōu)級(jí)純)：北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；磷酸二氫鈉(分析純)：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；磷酸(MOS級(jí))：北京化學(xué)試劑研究所產(chǎn)品；氫氧化鈉(分析純)：北京化工廠產(chǎn)品；全氟庚酸：美國Sigma-Aldirich公司產(chǎn)品；亮氨酸、纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：由日本計(jì)量院提供；亮氨酸、纈氨酸同位素標(biāo)記物：美國劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-Aq(2.1 mm×150 mm×3.5 μm)；柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積2 μL，流速0.2 mL/min；流動(dòng)相：A為0.8 mmol/L全氟庚酸和0.05%三氟乙酸的水溶液，B為乙腈；進(jìn)樣量2 μL；洗脫梯度：0～5 min，15%B，5～20 min，30%B，20～30 min，30%B，30～40 min，70%B。

1.3.2質(zhì)譜條件 多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；監(jiān)測離子對：m/z117.1>m/z72.1(纈氨酸),m/z122.1>m/z75.1(C5-纈氨酸),m/z132.1>m/z86.1(亮氨酸),m/z142.1>m/z96.1(D10-亮氨酸)；碰撞誘導(dǎo)解離電壓100 V；碰撞能量8 eV。

1.4 樣品前處理方法

取100 μL CRP于安瓶中，按質(zhì)量比1∶1分別加入纈氨酸和亮氨酸標(biāo)記溶液，真空干燥。然后加入800 mL 6 mol/L HCl，混合均勻后，通氮除氧，密封，在110 ℃烘箱中水解，每隔12 h渦旋混勻1次。水解48 h后取出，氮?dú)獯蹈?，用含?.1%鹽酸的水溶液復(fù)溶，溶液經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后，上機(jī)測定[14]。

1.5 結(jié)果計(jì)算

按照低標(biāo)—樣品—高標(biāo)—樣品—低標(biāo)的順序測定，同位素比例分別為0.9和1.1。

樣品的氨基酸濃度為：

c氨基酸=

其中：m標(biāo)為樣品溶液中氨基酸同位素標(biāo)記物的質(zhì)量；I樣為樣品氨基酸與氨基酸標(biāo)記物的峰面積比；W1為高標(biāo)溶液氨基酸與氨基酸標(biāo)記物的質(zhì)量比；W2為低標(biāo)溶液氨基酸與氨基酸標(biāo)記物的質(zhì)量比；I1為高標(biāo)溶液氨基酸與氨基酸標(biāo)記物的峰面積比；I2為低標(biāo)溶液氨基酸與氨基酸標(biāo)記物的峰面積比；M為樣品質(zhì)量；P為氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度。

根據(jù)C-反應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)和測得的氨基酸濃度，計(jì)算對應(yīng)蛋白的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 比對樣品測量結(jié)果

本次比對樣品為同一濃度的2個(gè)樣品，分別記為A樣和B樣。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白水解樣品在液相色譜-同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜上的分離情況示于圖1、圖2。

從2個(gè)樣品中分別取3份子樣進(jìn)行同位素稀釋質(zhì)譜法的測定，結(jié)果列于表1～3。

1號(hào)實(shí)驗(yàn)室是韓國計(jì)量院，2號(hào)實(shí)驗(yàn)室是中國計(jì)量院，3號(hào)實(shí)驗(yàn)室是日本計(jì)量院，日本計(jì)量院采用了氣相和微波消解兩種方法。與日本計(jì)量院的結(jié)果相比，韓國計(jì)量院的測定結(jié)果稍低，

中國計(jì)量院的測定結(jié)果稍高，但都處于日本計(jì)量院的測定結(jié)果不確定度范圍內(nèi)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品(a)和C-反應(yīng)蛋白檢測樣品(b)的氨基酸分離Fig.1 Amino acid separation of standard sample(a) and CRP sample(b)

注：a.纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；b.亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；c.人CRP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的纈氨酸分離；d.人CRP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的亮氨酸分離圖2 人C-反應(yīng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的氨基酸分離Fig.2 The amino acid separation for CRP CRM

樣品編號(hào)樣品濃度/(mmol/kg)A樣41.56B樣41.48平均值41.52不確定度0.91(k=2)

表3 中日韓C-反應(yīng)蛋白比對結(jié)果Table 3 The comparison results of C-reactive protein international for Japan， South Korea and China

2.2 測量結(jié)果不確定度

將各個(gè)不確定度分量合成，由式(1)計(jì)算得

到標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(1)

對應(yīng)95%置信水平，取包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度為U=k·u。方法重復(fù)性為A類不確定度，其余為B類不確定度，計(jì)算結(jié)果列于表4。

3 結(jié)論

此次重組人C-反應(yīng)蛋白純蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值比對由日本計(jì)量院組織發(fā)起，韓國計(jì)量院和日本計(jì)量院的結(jié)果與中國計(jì)量院測定的結(jié)果取得了等效一致。證明了三家計(jì)量院在人C-反應(yīng)蛋白純蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)上的測定能力，同時(shí)也證明了中國計(jì)量院所使用的定值方法準(zhǔn)確可靠。本次比對研究了可能影響標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的各種因素，為研究蛋白質(zhì)類大分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)積累了寶貴經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)驗(yàn)證了國內(nèi)CRP純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值方法，并為相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

表4 C-反應(yīng)蛋白不確定度計(jì)算

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