林紅麗，王嵩，王宇鵬，欒云艷，余麗蕓，侯喜林

（1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院）

雞傳染性法氏囊病（Infection Bursal Disease,IBD）是由傳染性法氏囊病毒（IBDV）引起雞的一種急性、高度接觸性傳染病，主要發(fā)生于3～6 周齡雛雞。不僅引起大批死亡還可導致免疫抑制[1]。目前市場上用于預防IBDV 的商品疫苗多為中等毒力疫苗。然而此類疫苗免疫時間往往不易掌握，免疫時期不對，就會對雞法氏囊造成損傷，造成機體免疫抑制[2-4]。鑒于此，研制一種安全有效的抗IBDV 疫苗已經迫在眉睫。預防雞傳染性法氏囊病的基因工程亞單位疫苗以其安全、方便等優(yōu)點已經成為目前國內外研究的熱點。

近十幾年，乳酸菌表達系統(tǒng)得到充足的發(fā)展。乳酸菌除了可以調節(jié)機體胃腸道微生態(tài)平衡，抑制病菌之外[5]，它還可以作為外源基因表達遞送的載體。此外，干酪乳桿菌表達系統(tǒng)不需要誘導劑的誘導，即可成功表達外源蛋白，這樣既減少了誘導劑對菌體的侵害，又便于操作，是未來潛在的疫苗表達載體。而VP2 蛋白是IBDV 主要結構蛋白和保護性抗原成分，與病毒中和性抗體的誘導和識別等生物學功能有關，它與另一主要結構蛋白（VP3）一起構成IBDV核衣殼的骨架。有研究證實VP2 蛋白主要暴露在核衣殼的外面，攜帶病毒主要的中和性抗原表位[6]。本研究將應用pHCE1LB-pgsA（pLA）載體構建干酪乳桿菌表達系統(tǒng)表達IBDV VP2 蛋白，為雞傳染性法氏囊病的基因工程亞單位疫苗的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細菌和表達載體

傳染性法氏囊病毒B87 株疫苗株購自哈爾濱維科生物技術有限公司；干酪乳桿菌CICC6105（Lactobacillus casei CICC6105）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；大腸桿菌DH5α 菌株由實驗室保存；干酪乳桿菌表達載體pHCE1LB-pgsA（pLA）由實驗室保存；pMD18-T 載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 主要試劑

LA Taq DNA 聚合酶（125 U·μL-1）、限制性核酸內切酶BamHⅠ、SalⅠ、T4DNA 連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司，雞源的抗IBDV 多抗血清由黑龍江八一農墾大學預防獸醫(yī)學實驗室贈送，兔源抗pgsA 多抗血清由黑龍江八一農墾大學基因工程實驗室贈送；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG 抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗雞IgG 抗體、FITC 標記的羊抗雞IgG 二抗、FITC 標記的羊抗兔IgG 購自北京博奧森生物技術有限公司，預染蛋白質Marker 購自Fermentas 公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建

根據(jù)GeneBank 中發(fā)表的B87 株VP2 蛋白基因序列（序列號為DQ906921.1），應用Blast 和Oligo 6.0設計一對帶有酶切位點的特異性引物（表1），在基因保守區(qū)上游和下游引物5′端設計保護性堿基，并加入BamHⅠ和SalⅠ酶切位點（黑色加粗堿基），預計擴增片段為1 345 bp。將目的片段克隆在T 載體上，構建pMD-VP2，在大腸桿菌中增殖。然后將外源基因VP2 構建在pLA 載體上，構建重組質粒pLA-VP2，電轉到干酪乳桿菌中，鑒定正確的命名為pLA-VP2。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 外源蛋白的表達及反應原性的鑒定

取重組菌pLA-VP2，按2%接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜靜置培養(yǎng)。次日，按2%接種于含34 μgmL-1氯霉素的10 mL MRS 培養(yǎng)基中。取表達6 h 的菌液1 mL，進行SDS-PAGE 檢測目的蛋白（5%的濃縮膠，12%的分離膠）。

應用半干式轉移電泳槽進行Western blot 檢測。取表達6 h 的重組菌和空載體菌的蛋白處理樣品進行12%的SDS-PAGE，剪一個尼龍膜和6 個3 mm 厚的濾紙，保持其大小與待轉凝膠大小相同。剪好的濾紙與尼龍膜以及待轉凝膠一起放入轉膜緩沖液中浸潤15 min。然后依次在轉印槽的陽極板上從下到上放置3 張濾紙，然后是尼龍膜和凝膠，再放置3 張濾紙，最后蓋上陰極蓋，通電75 min。通電結束后凝膠中的蛋白質就將轉移至尼龍膜上。將轉移好的膜浸入5%脫脂乳中，在水平搖床上4 ℃條件下緩慢搖動，過夜封閉。次日，將封閉好的膜浸入PBST 中，在水平搖床緩慢搖動3 次，每次10 min；然后將膜浸入以1∶500 稀釋的抗IBDV 多抗血清中，室溫緩慢振搖2 h；用PBST 溶液洗膜3 次，每次10 min；然后將膜浸入以1∶5 000 稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗雞IgG 抗體中，室溫緩慢振搖1 h；PBST 洗滌膜3 次，最后用DAB 顯色試劑盒顯色，觀察結果。pgsA 多克隆抗體檢測重組蛋白方法同上。

1.2.3 流式細胞檢測表達效率

作為確定檢測樣品為陽性的閾值標準，應用對照組曲線同實驗組曲線交叉法，即以交叉點為界，分別計算出陽性組曲線覆蓋面積及對照組延伸到陽性組下的面積，以前者減去后者獲得的數(shù)據(jù)，即為陽性組所占比例。為了使免疫熒光的定量概念更加完整，在陽性百分比基礎上加入熒光強度（FI）指標。此值除了以對照組及實驗組的曲線峰值的常規(guī)方法確定外，更準確的是擬合曲線法估計熒光強度的平均值和標準差。

取MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h 的重組干酪乳桿菌pLA-VP2 和干酪乳桿菌pLA 各1 mL，經300 目篩網(wǎng)過濾后，6 000 r·min-1離心5 min，收集菌體沉淀。用PBS 吹洗三次，調整細胞濃度為5×106個·mL-1，離心收集菌體，加入PBS（含5% BSA），4 ℃封閉過夜。6 000 r·min-1離心5 min，用PBS 再次吹洗三次，加雞源的IBDV 多抗血清和兔源的pgsA 多抗血清，4 ℃作用4 h。6 000 r·min-1離心5 min，用PBS吹洗三次，加入FITC 標記羊抗雞的IgG 熒光二抗（1∶100 稀釋）和FITC 標記羊抗兔的IgG 熒光二抗（1∶100 稀釋），4 ℃避光作用5 h。6 000 r·min-1離心5 min，用PBS 洗滌三次。取105個細胞，流式細胞儀檢測，根據(jù)正態(tài)曲線計算陽性率。

2 結果

2.1 IBDV VP2 基因擴增及克隆

以反轉錄的cDNA 為模板，通過設計的特異性引物進行PCR 擴增。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見一條約1 345 bp 的特異性條帶（圖1），與預期DNA 片段大小一致。

圖1 RT-PCR 產物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR product

重組pMD-VP2 質粒經BamHⅠ/SalⅠ雙酶切，結果切出大小約為2 692 bp 和1 345 bp，與預期結果相符（圖2）。重組質粒pMD-VP2 測序后，應用DNAStar 軟件將IBDVB87 株VP2 基因與GenBank中發(fā)表的序列號為DQ906921.1 的基因進行比對，其同源性達到99.4%。

2.2 pLA-VP2 重組質粒PCR 鑒定結果

電轉后的干酪乳桿菌經增殖后提取質粒進行PCR 鑒定（圖3）。以干酪乳桿菌轉化子為模板，通過設計的IBDV VP2 基因特異性引物進行PCR 擴增，擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約1 345 bp 的特異性條帶，與預期結果相符。

圖2 重組質粒pMD-VP2 的酶切鑒定Fig.2 Identification of pMD-VP2 by enzyme digestion

圖3 重組干酪乳桿菌轉化子pLA-VP2 PCR 鑒定結果Fig.3 Identification of recombinant plasmid by PCR

2.3 重組蛋白的Western blot 檢測結果

取經表達6 h 的重組菌經SDS-PAGE 后，切膠，經尼龍膜轉印后，分別與雞源抗IBDV 多抗血清（圖4 A），DAB 顯色試劑顯色后，在預期位置出現(xiàn)明顯的條帶（約90 kDa），與預計大小一致，而含空質粒pLA對照未見條帶；再經兔源的pgsA 多抗血清（圖4 B）作用，DAB 顯色試劑盒顯色后，在預位置出現(xiàn)約90 kDa 的明顯條帶，與預計大小一致，而含空質粒pLA 對照出現(xiàn)約41 kDa 的明顯條帶；說明pgsA 標簽蛋白成功表達并可被兔源抗pgsA 血清識別，雞源抗IBDV 血清可以特異性識別重組蛋白。

圖4 重組蛋白Western blot 檢測結果Fig.4 Western blot analysis of the recombinant protein

2.4 重組干酪乳桿菌流式細胞檢測結果

攜帶pLA-VP2 重組質粒的干酪乳桿菌與只攜帶pLA 的干酪乳桿菌共同利用流式細胞儀檢測，以雞源抗IBDV 多抗血清作為一抗，以羊抗雞IgG/FITC作為二抗，利用流式細胞儀檢測熒光信號，繪制成直方圖（圖5）。結果：pLA 電轉的干酪乳桿菌表明的熒光信號顯著低于干酪乳桿菌表達pLA-VP2 的試驗組，表明干酪乳桿菌成功表達外源蛋白VP2。為確定檢測樣品陽性的百分比，應用對照組曲線同試驗組曲線交叉法，即以交叉點為界，分別應用正態(tài)分布函數(shù)計算出陽性組曲線覆蓋面積及對照組延伸到陽性組下的面積，以前者減去后者獲得的數(shù)據(jù)，即為陽性組所占比例。計算結果為陽性所占比例為80%，即重組干酪乳桿菌表達IBDV VP2 蛋白表達率為80%。

圖5 重組干酪乳桿菌的流式細胞檢測結果Fig.5 Fluorescence-activated cell sorter analysis of the recombinant protein

3 討論

IBDV 的基因工程亞單位疫苗是目前國內外研究的熱點。在過去的30年里，已經報道了多種重組的表達體系表達VP2 蛋白，IBDV 的衣殼蛋白VP2蛋白攜帶有病毒主要的中和性抗原表位[7]。目前已經有多種不同的表達系統(tǒng)獲得應用，如大腸桿菌、酵母菌、禽痘病毒、桿狀病毒、塞姆利基森林病毒等[8]，甚至是植物表達系統(tǒng)[9]。在一些研究中應用重組的VP2蛋白進行免疫，一些甚至可以提供100%的保護。迄今為止，已有三種基于重組VP2 蛋白的表達系統(tǒng)制備亞單位疫苗在一些國家已經投放市場，分別為桿狀病毒、大腸桿菌和畢赤酵母菌[10]。這些都充分證明了利用IBDV 的VP2 蛋白制備亞單位疫苗的可行性。

該研究構建了pLA-VP2 重組質粒，應用干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，LAB）表達雞傳染性法氏囊病毒B87 株VP2 蛋白，將VP2 蛋白展示在干酪乳桿菌表面。質粒pLA 是一種穿梭質粒，它既可以在大腸桿菌中復制，又可以在乳酸菌中復制。在位于HCE啟動子下游，第238～251 序列編碼一種名叫pgsA 的錨釘?shù)鞍?，它具有將外源基因錨釘在細胞表面的作用。pgsA 穿插在乳酸菌的細胞壁上，外源蛋白通過N端與pgsA 相連，從而錨釘在菌體表面。在研究中構建的pLA-VP2 重組質粒，就是利用干酪乳桿菌表達系統(tǒng)表達pgsA-VP2 融合蛋白，外源蛋白VP2 被pgsA 錨釘在菌體上，使得VP2 蛋白成功展示在菌體表面。

Western Blot 檢測重組蛋白VP2，結果顯示重組干酪乳桿菌表達的VP2 蛋白可以與IBDV 多抗血清發(fā)生特異性免疫反應，證明構建的重組干酪乳桿菌表達的VP2 蛋白結構與天然抗原結構相似，具有較好的反應原性。乳酸菌表達外源蛋白分兩種情況：分別為菌內表達和菌體表面表達。蛋白如果在菌體內部表達，抗體無法進入菌體內部與蛋白結合，熒光無法標記在蛋白上，經過流式細胞儀時，熒光無法被檢測器捕捉；蛋白在菌體表面表達，經熒光（FITC）標記二抗處理過的干酪乳桿菌表面就會帶有熒光，即被流式細胞儀的散射光檢測器捕捉，產生熒光信號；此外pLA-VP2 重組菌熒光強度高于pLA 菌對照組，這些都充分證明了VP2 已成功展示在干酪乳桿菌表面。研究為IBDV 基因工程亞單位疫苗的研制又提供了一個可行性的表達系統(tǒng)。

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