王素娟，鄭承劍，岳 偉，龔穎珍，秦路平*

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,銀川 750004;2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室,上海 200433)

蜘蛛香藥材為敗醬科纈草屬植物蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)的干燥根莖和根，具有疏散風(fēng)熱、利咽、透疹、明目退翳、解痙等功效，主要用于治療風(fēng)熱感冒、眼痛音啞、麻疹不透、風(fēng)疹瘙癢、目赤翳障、驚風(fēng)抽搐和破傷風(fēng)[1]。藥理學(xué)研究表明，蜘蛛香還具有抗焦慮和抗氧化等藥理作用[2，3]。蜘蛛香藥材中起鎮(zhèn)靜、安神作用的主要活性成分為纈草素類化合物[4]，包括纈草三酯、乙酰纈草三酯和二氫纈草三酯等。《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部收載了蜘蛛香，規(guī)定該藥材按干燥品計(jì)算纈草三酯和乙酰纈草三酯總含量必須≥0.80%[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道用HPLC法測(cè)定蜘蛛香中纈草三酯、乙酰纈草三酯及其分解產(chǎn)物 baldrinal的含量[5]。本研究建立了HPLC法，測(cè)定四川、云南、貴州三省所產(chǎn)蜘蛛香藥材中4種含量較高的纈草素類化合物(纈草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P、Jatamanvaltrate Q)的含量，以進(jìn)一步完善蜘蛛香藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 1200系列HPLC儀、二極管陣列檢測(cè)器、Chemstation 10.2色譜工作站、Eclipse OB-C18色譜柱(美國(guó)安捷倫公司)；AL104電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；USC-702型超聲波清洗器(上海波龍電子設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑和藥材 纈草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q的對(duì)照品(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室自制)，結(jié)構(gòu)經(jīng)UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR及2D NMR鑒定，用HPLC法檢測(cè)含量>98%。甲醇、乙腈(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為重蒸餾水(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院自制)。蜘蛛香藥材購(gòu)自安徽省亳州市藥材市場(chǎng)和成都國(guó)際商貿(mào)城荷花池中藥材專業(yè)市場(chǎng),產(chǎn)地分別為貴州省貴陽(yáng)市、云南省師宗縣、四川省成都市，均經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室秦路平教授鑒定為蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)的干燥根莖和根。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 Eclipse OB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脫，0～20 min A∶B=75∶25，20～25 min A∶B=87∶13,25 min以后A∶B=75∶25；流速0.8 ml/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)256 nm；進(jìn)樣量20 μl。

2.2 溶液的配制 (1)對(duì)照品溶液：取干燥至恒重的纈草三酯、Chlorovaltrate[6]、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q[7]對(duì)照品適量，精密稱定，置10 ml量瓶中，加適量甲醇溶解，再加甲醇至刻度，搖勻，得到纈草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q濃度分別為0.09、0.10、0.06、0.05 mg/ml的混合對(duì)照品溶液。(2)供試品溶液：取蜘蛛香藥材(編號(hào)GZ07)2.0 g，精密稱定，置100 ml錐形瓶中，精密加入50 ml甲醇，密塞，稱定質(zhì)量。在超聲儀中超聲提取30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，以甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。(3)陰性對(duì)照溶液：以甲醇作為陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，得到色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，4種纈草素類化合物分離良好，基質(zhì)對(duì)主藥峰無(wú)干擾。與對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖相比，陰性對(duì)照溶液的基線呈斜線，考慮可能是由于纈草素類化合物的存在增大了溶液的黏性，從而使基線有所不同。

圖1 蜘蛛香的HPLC譜圖

2.4 線性關(guān)系的考察 取2.2項(xiàng)的混合對(duì)照品溶液2、6、10、14、18、22、26 μl分別進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，見(jiàn)表1。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2項(xiàng)的混合對(duì)照品溶液，平行測(cè)定7次，計(jì)算RSD。結(jié)果纈草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q的RSD分別為1.31%、1.41%、2.82%和1.35%(n=7)。

2.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取蜘蛛香藥材粉末(編號(hào)GZ07)，精密稱取4份，每份2.0 g，按2.2項(xiàng)下(2)方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μl，測(cè)定纈草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q的峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果上述4種成分的RSD分別為2.08%、1.43%、1.86%和1.39%(n=4)。

表1 4種纈草素類化合物的線性回歸方程

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取蜘蛛香藥材粉末5份(編號(hào)GZ07)，每份2.0 g，分別加入2.2項(xiàng)的混合對(duì)照品溶液1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 μl，然后按2.2項(xiàng)(2)方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果測(cè)得纈草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q的平均加樣回收率分別為(99.72±0.33)%、(97.74±1.05)%、(99.90±0.77)%和(100.03±1.47)%(n=5)。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取室溫儲(chǔ)存的供試品溶液(編號(hào)GZ07)，分別于配制后0、4、8、12、16、24 h測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果纈草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q的RSD分別為2.78%、1.98%、2.21%和2.62%(n=3)，表明供試品溶液室溫儲(chǔ)存24 h基本穩(wěn)定。

2.9 樣品含量測(cè)定 將云南、四川、貴州三省所產(chǎn)蜘蛛香藥材按2.2項(xiàng)(2)方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 蜘蛛香中4種纈草素類成分含量測(cè)定結(jié)果

Table 2 The results of content determination of 4 valepotriate compounds in Valeriana jatamansi Jones

表2 蜘蛛香中4種纈草素類成分含量測(cè)定結(jié)果

產(chǎn)地編號(hào)纈草三酯Chlorovaltrate Jatamanvaltrate P Jatamanvaltrate Q貴州GZ01 0．764 8±0．000 2 0．099 5±0．000 5 0．018 0±0．004 0 0．143 5±0．000 9貴州GZ04 0．043 4±0．000 4 0．082 0±0．000 4 0．019 7±0．000 5 0．075 8±0．000 1貴州GZ05 6．469 0±0．000 7 0．152 8±0．000 2 0．012 3±0．000 3 0．105 8±0．000 3貴州GZ07 0．882 8±0．000 8 0．212 0±0．000 2 0．063 8±0．000 3 0．710 0±0．000 5云南YN02 3．999 5±0．000 5 0．114 8±0．000 3 0．021 3±0．000 4 0．142 0±0．000 1云南YN03 0．553 0±0．000 1 0．137 0±0．000 6 0．105 5±0．000 5 0．749 5±0．000 8四川SC06 0．553 0±0．000 4 0．097 8±0．000 2 0．016 8±0．000 5 0．146 0±0．000 2

3 討 論

本研究對(duì)供試品溶液的制備條件進(jìn)行了考察，分別以加熱回流、超聲提取、滲漉方式提取蜘蛛香藥材中4種纈草素類化合物。由于蜘蛛香藥材中所含主要活性成分為環(huán)烯醚萜類化合物，高溫加熱可使其分解；滲漉提取所需時(shí)間較長(zhǎng)；考慮超聲提取耗時(shí)短，提取率高，故采用超聲提取法。作者考察了以甲醇-水和乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相的色譜行為，甲醇-水系統(tǒng)對(duì)纈草三酯和Chlorovaltrate的分離度較差，而乙腈-水系統(tǒng)的分離度較好，故選用乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定采用梯度洗脫法分離效果較好。有文獻(xiàn)報(bào)道用HPLC法測(cè)定蜘蛛香藥材中纈草三酯、乙酰纈草三酯及其分解產(chǎn)物 baldrinal的含量[5]，但并無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道同時(shí)測(cè)定纈草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q此4種纈草素類化合物的方法。本研究首次采用HPLC法同時(shí)測(cè)定了蜘蛛香藥材中纈草三酯、Chlorovaltrate、Jatamanvaltrate P和Jatamanvaltrate Q的含量，4種成分基線分離良好，精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性符合要求，可用于蜘蛛香藥材的質(zhì)量控制。

【參考文獻(xiàn)】

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.2010版 一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：345-346.

State Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China.2010 ed.Volume 1[S].Beijing：Chinese Medical Science Press，2010：345-346.In Chinese.

[2]You JieShu，Peng Min，Shi JinLi，etal.Evaluation of anxiolytic activity of compoundValerianajatamansiJones in mice[J].BMC Complement Altern Med，2012，12：223.

[3]Bhatt I D，Dauthal P，Rawat S，etal.Characterization of essential oil composition，phenolic content，and antioxidant properties in wild and planted individuals ofValerianajatamansiJones[J].Sci Hortic，2012，136：61-68.

[4]都曉偉，吳軍凱.纈草屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)藥植物藥分冊(cè)，2006，21(1)：10-14.

Du XiaoWei，Wu JunKai．Advances in research on chemical components and pharmacological activities ofValerianaplants[J]．World Notes Plant Med,2006，21(1)：10-14.In Chinese.

[5]狄宏曄,石晉麗,閆興麗,等.HPLC法測(cè)定蜘蛛香中纈草素、乙酰纈草素及其分解產(chǎn)物 baldrinal[J].中草藥，2007,38(12)：1892-1894.

Di HongYe，Shi JinLi，Yan XingLi，etal.Determination of valtrate，acevaltrate，and their degradation product-baldrinal inValerianawallichiiby HPLC analysis[J].Chin Tradit Herb Drugs,2007,38(12)：1892-1894.In Chinese with English abstract.

[6]Lin Sheng，Zhang ZhongXiao，Chen Tao，etal.Characterization of chlorinated valepotriates fromValerianajatamansi[J].Phytochemistry，2013,85：185-193.

[7]Wang SuJuan，Qiu XiaoQian，Zhu JianYong，etal.Two new iridoids from the root and rhizome ofValerianajatamansiJones[J].Helv Chim Acta,2014,97.