尹 紅,朱豐海，辛海量

(1.解放軍總醫(yī)院藥品保障中心，北京 100853；2.上海警備區(qū)第五干休所門診部，上海 200336；3.第二軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系，上海 200433)

刺五加又名五加參、刺拐棒，是五加科植物刺五加[Acanthopanaxsenticosus(Rupr. et Maxim.)Harms]的根和根莖，在我國歷代本草典籍中多有記述?！侗静菥V目》載刺五加“補中益氣，堅筋骨，強意志，久服輕身耐老”。該藥性溫，味辛、微苦，無毒，入脾腎經(jīng)；能扶正固本、補腎健脾、益智安神；主治脾腎陽虛，腰膝酸軟，體虛乏力，失眠，多夢，食欲不振。近年來，國內(nèi)外學(xué)者經(jīng)過大量的實驗，證實刺五加含有多種活性成分，如酚苷、多糖、氨基酸等[1,2]。藥理作用研究表明，刺五加可增強機體非特異性防御能力，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射損傷及抗疲勞等作用，可治療神經(jīng)衰弱、糖尿病和心腦血管疾病等[2]，其對慢性疲勞綜合征的作用是目前研究的熱點之一。本研究觀察刺五加根提取物[Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.) Harms extract, ASE]的抗慢性疲勞(chronic fatigue,CF)作用及對CF大鼠下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)軸的影響，探討其抗疲勞機制。

1 材 料

1.1 動物 將健康普通級雄性SD大鼠30只，體重(200±20) g[購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，動物合格證號SCXK-(軍)2010-081]。將大鼠分籠喂養(yǎng)，自由飲食，在室溫23～28 ℃，濕度40%～70%的動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，照明時間隨同自然變化。

1.2 藥品和試劑 刺五加根提取物(ASE，AS204856)，主要成分是刺五加苷B+E，為棕黃色粉末(寧波金艾農(nóng)生物科技有限公司)。促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)、皮質(zhì)酮、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素(corticotropin releasing hormone，CRH)放射免疫試劑盒(上海市生物制品研究所放免室)；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)。PCR所需試劑和抗體(Biotech)信息見下文方法描述。其他試劑均為市售分析純。

1.3 儀器 Bio-Rad MyIQ5實時(real time)PCR (RT-PCR)儀，WFZ UV-2800H紫外分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)；1-15K型臺式高速冷凍離心機(上海安亭儀器廠)。

2 方 法

2.1 動物分組及給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，大鼠按照體重分層隨機分為5組：對照組、CF組和ASE 50、100、200 mg/kg組， 每組6只。 5周適應(yīng)性訓(xùn)練后開始給藥， 分別灌胃給予生理鹽水、 生理鹽水和ASE 50、100、200 mg/kg，灌胃容積均為0.8 ml/kg。每天給藥1次，共21 d。

2.2 CF大鼠模型的建立 除對照組6只大鼠外，其余24只大鼠均先于動物跑臺上進行5周適應(yīng)性訓(xùn)練：每天訓(xùn)練20 min，跑臺的坡度為0度，跑速每周遞增，依次為15、22、27、31、35 m/min，每周訓(xùn)練6 d。然后進行3 周的大強度耐力訓(xùn)練，每天訓(xùn)練35 min， 坡度為0，速度為35 m/min。訓(xùn)練共8周[3]。力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)為動物跟不上預(yù)定速度，大鼠臀部壓在籠具后壁，后肢隨轉(zhuǎn)動皮帶后拖達30 s，毛刷刺激驅(qū)趕無效，四肢無力支持住身體、頭部低垂、電刺激后不能繼續(xù)正常奔跑。行為特征為呼吸深急、幅度大、精神疲倦，俯臥位垂頭，刺激后無反應(yīng)。

2.3 取材 訓(xùn)練第8周末稱大鼠體重并進行跑臺力竭實驗，分別記錄各組跑至力竭的時間。實驗結(jié)束時立即用乙醚輕度麻醉，眼眶取血6 ml，4 ℃靜置30 min后，1.2×103×g離心15 min，分離上層血清。采血后迅速斷頭，鼠頭放在冰盤上分離大鼠下丘腦，于液氮灌中速凍，并于-80 ℃冷藏備用。

2.4 檢測方法

2.4.1 CRH、ACTH和皮質(zhì)酮的血濃度的測定 應(yīng)用放射免疫分析法測定，由北京福瑞生物工程公司協(xié)助測定。

2.4.2 RT-PCR檢測促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素受體1(corticotropin releasing hormone receptor 1，CRHR1) mRNA 取下丘腦組織放入1.5 ml的Eppendorf離心管內(nèi)，加入300 μl的Trizol，按RNA抽提試劑盒說明書操作，提取組織總RNA備用(吸光度A260/280在1.8左右，表明RNA分子完整)。按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，并以cDNA為模板，采用熒光定量試劑盒SYBR Primer Script PCR Kit進行PCR反應(yīng)，CRHR1和內(nèi)參物還原磷甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物、產(chǎn)物大小、退火溫度及循環(huán)數(shù)見表1。根據(jù)產(chǎn)物擴增曲線、CT值(表示每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))、 熔解曲線分析擴增效率， 優(yōu)化反應(yīng)條件， 最終確定為： 取1∶5稀釋的cDNA 2 μl，加入2×SYBR Premix ExTaq 12.5 μl，上、下游引物各1 μl(終濃度10 μmol/L)， 去離子水8.5 μl， 總反應(yīng)體系 25 μl。RT-PCR反應(yīng)條件，采用2復(fù)孔進行反應(yīng)；預(yù)變性：95 ℃ 10 min，變性：95 ℃ 10 s，熔解溫度(Tm) 40 s，共40 個循環(huán)；延伸：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。從Tm到95 ℃每上升0.5 ℃取一次熒光值，最后生成熔解曲線，確定反應(yīng)產(chǎn)物的單一性。圖像定量分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到與每個樣本CT值對應(yīng)的模板中目的基因的濃度，結(jié)果用目的基因與內(nèi)參(GAPDH)的相對表達量表示。

表1 引物序列和實驗條件

3 結(jié) 果

3.1 ASE對CF大鼠力竭時間的影響 用藥后，CF組，ASE 50、100、200 mg/kg給藥組大鼠運動的力竭時間依次為(72.2±1.72)、(77.4±4.92)、(84.0±4.86)、(96.4±3.61) min，與CF組比較，100、200 mg/kg ASE組大鼠的力竭時間明顯延長，差異有顯著意義(P<0.01)。說明ASE可有效延長CF大鼠的力竭時間，有明顯的抗疲勞作用。

3.2 ASE對CF大鼠ACTH、CRH、皮質(zhì)酮血清濃度和下丘腦CRHR1mRNA表達的影響 ASE對CF大鼠ACTH、CRH、皮質(zhì)酮血清濃度和下丘腦CRHR1mRNA表達的影響見表2。由表2可見，與對照組相比，CF組大鼠血清ACTH、CRH和皮質(zhì)酮的含量均有明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。ASE 50、100、200 mg/kg組大鼠血清ACTH、皮質(zhì)酮、CRH含量與CF組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

RT-PCR實驗顯示，CRHR1mRNA 引物擴增CT值為18.59～30.73，熔解曲線分析特異性產(chǎn)物Tm值為(52±1) ℃，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.998。GAPDH引物擴增CT值為13.28～24.88，熔解曲線分析特異性產(chǎn)物Tm值為(58±1) ℃，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)0.999 4。從表2可見，CF組大鼠下丘腦CRHR1mRNA的相對表達量與對照組比較，有明顯增加(P<0.01)；ASE 50、100、200 mg/kg可有效抑制CF引起的CRHR1mRNA水平的升高(P<0.05,P<0.01)。

表2 刺五加提取液對慢性疲勞大鼠ACTH、CRH、皮質(zhì)酮血清濃度和下丘腦CRHR1 mRNA表達的影響

Table 2 Effects of ASE on serum levels of ACTH, CRH, corticosterone and the expression of CRHR1 mRNA in chronic fatigue rats

表2 刺五加提取液對慢性疲勞大鼠ACTH、CRH、皮質(zhì)酮血清濃度和下丘腦CRHR1 mRNA表達的影響

**P<0.01，與對照組比較；△P<0.05，△△P<0.01，與慢性疲勞組比較；ASE：刺五加提取液；ACTH：促腎上腺皮質(zhì)激素；CRH：促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素；CRHR1：促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素受體1；GAPDH：還原磷甘油醛脫氫酶

組別ACTH(ρB/pg·ml-1)CRH(ρB/ng·ml-1)皮質(zhì)酮(ρB/ng·ml-1)CRHR1mRNA/GAPDH對照組21．90±1．00 6．79±0．60 284．39±3．20 1．00±0．16慢性疲勞組30．49±2．20＊＊14．16±1．17＊＊370．10±21．39＊＊1．80±0．56＊＊刺五加提取液50mg/kg組22．74±1．12△△10．24±1．52 267．36±4．98△△1．65±0．27△刺五加提取液100mg/kg組17．76±1．02△△6．40±0．05△△248．45±1．31△△1．50±0．18△△刺五加提取液200mg/kg組18．67±0．89△△6．21±0．47△△291．58±5．03△△1．20±0．21△△

4 討 論

應(yīng)激與慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome, CFS) 的發(fā)生是目前研究的熱點，眾多研究發(fā)現(xiàn)CF在CFS的發(fā)病中起了重要的作用[4]。精神應(yīng)激，精神、心理壓力，長期的腦力、體力勞動過度，負(fù)性生活事件，不良生活習(xí)慣等都可能使機體產(chǎn)生慢性應(yīng)激反應(yīng)，然后引起機體免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌等多系統(tǒng)的功能紊亂，最終導(dǎo)致以疲勞為主要表現(xiàn)的多組織、器官功能紊亂的CFS相關(guān)癥狀。HPA軸是機體內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)通路，當(dāng)有應(yīng)激發(fā)生時，此信號通過神經(jīng)的傳導(dǎo)進入機體的大腦皮層和邊緣系統(tǒng)，整合后的信號再傳入到下丘腦，合成、分泌CRH；CRH再通過垂體門脈血流到達垂體，在這里與相應(yīng)的受體結(jié)合，刺激垂體分泌ACTH；ACTH再經(jīng)血液循環(huán)到達腎上腺，在腎上腺與相應(yīng)的受體結(jié)合后刺激腎上腺皮質(zhì)合成和分泌糖皮質(zhì)激素[5]。在正常機體中，當(dāng)ACTH和糖皮質(zhì)激素升高時，可反饋抑制CRH和ACTH的分泌，但在發(fā)生應(yīng)激時，上述反饋抑制作用大大減弱，從而出現(xiàn)ACTH和皮質(zhì)酮的分泌高峰，導(dǎo)致HPA軸功能的亢進。若應(yīng)激持續(xù)存在，則可以出現(xiàn)下丘腦、垂體、腎上腺的重量改變及其功能的異常[6]。大多數(shù)的CFS病人在發(fā)病前存在長期的體力或情感的應(yīng)激，這種應(yīng)激狀態(tài)引起HPA軸功能的亢進，使得糖皮質(zhì)激素和其他激素釋放增加，這些激素量的增加會改變機體多系統(tǒng)的功能狀態(tài)，進而影響行為方式，最終出現(xiàn)疲勞、焦慮、記憶力減退等CFS的臨床癥狀[7，8]。

ASE明顯延長了大鼠跑臺運動時間，延緩了大鼠運動性疲勞的發(fā)生。這一結(jié)果可能與ASE含有多種活性成分有關(guān)，可降低血清CRH、ACTH、皮質(zhì)酮的激素水平，從而抑制了大強度運動造成大鼠體內(nèi)激素分解代謝持續(xù)增加，抑制了HPA軸亢奮有關(guān)。為了進一步闡明ASE對HPA軸的調(diào)節(jié)作用，作者還測定了其對下丘腦CRHR1mRNA表達的影響。結(jié)果顯示，ASE調(diào)節(jié)抑制CF大鼠HPA功能亢進，可能與其下調(diào)CRHR1mRNA的表達，從而調(diào)節(jié)了與CRHR1偶聯(lián)的信號通路有關(guān)。本研究為進一步探索ASE抗慢性應(yīng)激疲勞的下丘腦上行調(diào)控機制研究奠定了基礎(chǔ)，對運動能力的提高有重要意義，也為刺五加防治現(xiàn)代流行疾病提供了實驗依據(jù)。

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