林妙春，鄭建明，葉曉峰，游平弟,鄭長(zhǎng)業(yè)，洪永強(qiáng)

(福建省寧德市閩東醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，福安 355000)

氯吡格雷、阿司匹林用于缺血性心腦血管疾病的二級(jí)預(yù)防病人時(shí)，常發(fā)生氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance)[1]和阿司匹林抵抗(aspirin resistance)[2]現(xiàn)象，表現(xiàn)出較大的個(gè)體差異。其原因主要為代謝過(guò)程中所依賴的酶的個(gè)體差異，即單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)。氯吡格雷活化所依賴的CYP450酶存在遺傳多態(tài)性[3]，CYP2C19*2及CYP2C19*3等位基因突變可導(dǎo)致氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物生成減少，抗血小板作用減弱，造成血小板聚集。不同種族人群CYP2C19*2及CYP2C19*3等位基因突變的發(fā)生率不同。福建省福安市是畬族人口分布最多、最集中的地區(qū)。至今，閩東地區(qū)畬族人群CYP2C19基因多態(tài)性分布情況尚不清楚。本研究采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技術(shù)分析該人群CYP2C19基因多態(tài)性的分布，為進(jìn)行個(gè)體化用藥提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本、試劑和儀器 標(biāo)本采集：按知情同意原則，在福安市畬族村采集3代以上屬于畬族原住民的血液標(biāo)本。研究時(shí)間為2011年10月至2013年3月。漢族健康人群血液標(biāo)本為健康體檢所抽取的外周血，由福建省寧德市閩東醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

血液基因組DNA提取試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，瓊脂糖(上海生工公司)，PCR引物由上海生工公司合成并經(jīng)HPLC純化。PCR試劑盒、Sma Ⅰ內(nèi)切酶、BamH Ⅰ內(nèi)切酶、DNA低分子量對(duì)照品(加拿大Fermentas公司生產(chǎn)，廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司經(jīng)銷)。5332型PCR儀、5810R型低溫離心機(jī)、移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；UV-1800PC紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；JS-350型多功能水平電泳槽，JS-680B型凝膠成像圖像分析儀(上海培清科技有限公司)。

1.2 DNA提取 按血液基因組DNA提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)步驟操作，取含EDTA的抗凝血300 μl，進(jìn)行基因組DNA的提取。提取的DNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度(A)并計(jì)算濃度及純度，DNA濃度(μg/μl)=A260×50×稀釋倍數(shù)/1000，DNA純度=A260/A280。DNA于-20 ℃保存。

1.3 PCRCYP2C19*2的引物分別是Forward:5′-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3′ 和Reverse:5′-TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3′；CYP2C19*3的引物分別是Forward: 5′-TATTATTATCTGTTAACTAATATGA-3′和Reverse:5′-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3′[4]。PCR擴(kuò)增體系為25 μl，包含12.5 μl PCR混合緩沖液，1 μl DNA模版，1 μl 10 μmol/L的上游引物和下游引物。PCR反應(yīng)程序：(1) 94 ℃ 預(yù)變性5 min；(2)94 ℃變性1 min，57 ℃(CYP2C19*2)和54 ℃(CYP2C19*3)復(fù)性1 min，72 ℃延長(zhǎng)1 min，37個(gè)循環(huán)；(3)72 ℃延伸10 min。該擴(kuò)增程序在PCR儀上完成。

1.4 基因分型 采用PCR-RFLP進(jìn)行基因分型。CYP2C19*2和CYP2C19*3的PCR產(chǎn)物分別用Sma Ⅰ內(nèi)切酶和BamH Ⅰ內(nèi)切酶在37 ℃酶切1 h，酶切產(chǎn)物用3% 的瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 基因型分布頻率采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，Hardy-Weinberg遺傳平衡定律驗(yàn)證。等位基因頻率=等位基因出現(xiàn)的數(shù)目/總基因數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1CYP2C19各基因型電泳結(jié)果CYP2C19*2的Sma Ⅰ內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)突變，DNA片段不能被切割，顯示為169 bp的單一片段，基因型表示為CYP2C19*2/*2(如圖1中2、3條帶)；若酶切位點(diǎn)只有一側(cè)位點(diǎn)突變，酶切產(chǎn)物則顯示49 bp、120 bp、169 bp 3個(gè)片段，基因型表示為CYP2C19*1/*2(如圖1中5、6條帶)；野生型CYP2C19*1酶切位點(diǎn)未突變，DNA片段切割為49 bp和120 bp 2個(gè)片段，基因型表示為CYP2C19*1/*1(如圖1中條帶4)。CYP2C19*3的BamH Ⅰ內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)突變，DNA片段不能被切割，顯示為329 bp的單一片段，基因型表示為CYP2C19*3/*3(如圖2中1、2條帶)；若酶切位點(diǎn)只有一側(cè)位點(diǎn)突變，酶切產(chǎn)物則顯示96 bp、233 bp、329 bp 3個(gè)片段，基因型表示為CYP2C19*1/*3(如圖2中條帶3)；野生型CYP2C19*1酶切位點(diǎn)未突變，DNA片段切割為96 bp和233 bp 2個(gè)片段，基因型表示為CYP2C19*1/*1(如圖2中條帶4)。

圖1 CYP2C19*2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖(Sma Ⅰ 酶切)

圖2 CYP2C19*3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖(BamH Ⅰ酶切)

2.2CYP2C19各種基因型和等位基因 漢族和畬族人群CYP2C19各種基因型和等位基因頻率分布見(jiàn)表1、表2。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，表明這兩個(gè)基因的變異被閩東地區(qū)漢族和畬族人群所獲得，且變異率可維持在相應(yīng)的水平上。由表1可見(jiàn)，漢族人群中有21.4%存在CYP2C19*2突變純合體，高于畬族人群(9.4%)，差異顯著(P<0.05)；而兩個(gè)民族CYP2C19*3突變純合體的頻率相當(dāng)，分別為2.9%和2.2%，無(wú)顯著差異。漢族與畬族CYP2C19*2突變雜合體的頻率分別為28.6%和30.0%，CYP2C19*3突變雜合體的頻率分別為11.4%和16.7%。由表2可見(jiàn)，漢族CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因頻率均顯著高于畬族人群(P<0.05)。

表1 漢族和畬族人群CYP2C19基因型頻率

表2 漢族和畬族人群CYP2C19等位基因頻率

3 討 論

CYP是一類亞鐵血紅蛋白-硫醇鹽蛋白的超家族，是由一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的超基因家族編碼的同工酶，主要存在于肝細(xì)胞微粒體與線粒體內(nèi)膜上，是一種末端加氧酶，參與生物體內(nèi)多種藥物代謝。CYP450酶系最主要的三個(gè)家族是CYP1、CYP2和CYP3，其中最重要的7種是：CYP1A2、2A6、2C9、2C19、2D6、2E1、3A4。CYP450參與許多內(nèi)源性物質(zhì),如維生素D3、前列腺素、脂肪酸，及許多外源性物質(zhì)，如藥物、毒物的代謝。

對(duì)于缺血性心腦血管疾病，通常采用氯吡格雷、阿司匹林等進(jìn)行二級(jí)預(yù)防，臨床上已證實(shí)氯吡格雷抗血小板效果比阿司匹林好，但是價(jià)格較高。氯吡格雷作為一種新型噻吩并吡啶類衍生物，是一種前體藥物，需通過(guò)氧化作用轉(zhuǎn)化成2-氧基-氯吡格雷，然后再經(jīng)過(guò)水解形成活性代謝物(一種硫醇衍生物)，這一活性轉(zhuǎn)化主要依賴于肝臟CYP450酶作用。該活性代謝物通過(guò)選擇性地與血小板表面腺苷酸環(huán)化酶偶聯(lián)的二磷酸腺苷(ADP)受體P2Y12結(jié)合，選擇性地抑制由ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，同時(shí)氯吡格雷還可以阻斷血小板激活后級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，抑制非ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。然而，氯吡格雷活化所依賴的CYP2C19*2及CYP2C19*3等位基因的突變會(huì)導(dǎo)致抗血小板藥物的代謝減弱[5]。美國(guó)FDA強(qiáng)調(diào)CYP2C19*2及*3基因的重要性，并強(qiáng)調(diào)在該等位基因突變率極高的人群中使用氯吡格雷治療時(shí)應(yīng)慎重[6]。本研究選用CYP2C19*2及*3作為研究對(duì)象，主要是因?yàn)檫@兩個(gè)等位基因突變?cè)跂|方人中較為常見(jiàn)。CYP2C19*2代謝能力減弱主要表現(xiàn)在CYP2C19 cDNA外顯子5的681位點(diǎn)堿基G突變?yōu)锳，最終導(dǎo)致無(wú)功能蛋白酶的合成。CYP2C19*3的弱代謝則主要表現(xiàn)在CYP2C19 cDNA外顯子4的636堿基G突變?yōu)锳，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成提早終止。根據(jù)這兩個(gè)等位基因突變導(dǎo)致的代謝效率變化，可將個(gè)體分為弱代謝者 (poor metabolizers，PM)、中等代謝者 (intermediate metabolizers，IM)、廣泛代謝者 (extensive metabolizers，EM)以及超速代謝者 (ultra rapid metabolizers，UM)4種類型。研究數(shù)據(jù)顯示，亞洲人群(包括日本、菲律賓及中國(guó))CYP2C19*2及*3等位基因發(fā)生率均高于歐美及非洲國(guó)家人群[7,8]。而國(guó)內(nèi)各民族(包括漢族、傣族、白族、苗族、侗族等)CYP2C19*2及*3等位基因發(fā)生率亦存在差異[9]。

本研究首次測(cè)定了閩東地區(qū)畬族與漢族人群等位基因CYP2C19*2及*3的發(fā)生頻率，結(jié)果表明，畬族人群兩個(gè)等位基因發(fā)生頻率均低于漢族，且差異顯著。該結(jié)果與閆春蘭等[10]得到的結(jié)果不一致，浙江省畬族人群的CYP2C19*2發(fā)生頻率高于漢族(32.5%vs28%)。浙江省的畬族研究樣本來(lái)源于學(xué)生，大多數(shù)年齡較小。而本研究樣本年齡段在19～81歲，為原住民，在飲食方面更加偏向高鹽的傳統(tǒng)食物，且吸煙者比例較學(xué)生群體高。因此，推測(cè)年齡、飲食以及是否吸煙的差異是造成兩個(gè)研究結(jié)果不同的原因，有待更深入的研究。另有魏偉等[11]的研究指出，福建省漢族人群的CYP2C19*2和CYP2C19*3的發(fā)生頻率分別為32.4%和5.8%，低于本研究的結(jié)果。該研究樣本來(lái)源于福州地區(qū)健康體檢人員，而本研究漢族人群為福安地區(qū)健康體檢人員。地域、飲食等差異可能是造成結(jié)果不同的原因。

本研究結(jié)果表明，福建省福安地區(qū)畬族人群中弱代謝者比例較漢族低，因此可以預(yù)測(cè)畬族人群出血性腦卒中的治療使用氯吡格雷效果更佳。同一種族在不同地區(qū)基因型和等位基因頻率也有所差異，實(shí)施個(gè)體化治療的同時(shí)還應(yīng)該考慮地區(qū)因素。有研究表明，影響CYP2C19酶活性的因素除了基因型的不同外，還有性別、口服避孕藥、吸煙等[12]，因此臨床用藥時(shí)還需綜合考量各項(xiàng)因素。

總之，CYP2C19等位基因突變率在不同民族、不同地區(qū)之間存在差異性。本研究結(jié)果為臨床個(gè)體化用藥提供了參考依據(jù)。課題組今后將在藥物代謝與基因多態(tài)性關(guān)系上做進(jìn)一步研究，以促進(jìn)臨床上個(gè)體化治療。

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