臺宗光，朱全剛，戴子淵，高 申

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433；2.解放軍92330部隊(duì)醫(yī)院藥房，青島 266102；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，上海 200437；4.復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院藥劑科，上海 201102)

基因治療是將基因(主要為DNA或siRNA)傳遞到病人特定細(xì)胞中，從而促進(jìn)或抑制目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，達(dá)到治療人類疾病的目的[1]。由于基因片段容易被核酸酶降解，且?guī)ж?fù)電荷，相對分子質(zhì)量較大，很難通過帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，這就需要利用基因載體來保護(hù)并傳遞基因片段進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)[2]。基因載體既要保證高的轉(zhuǎn)染效率，又要有較低的細(xì)胞毒性。因此，發(fā)展低毒高效的基因傳遞載體是基因治療成功應(yīng)用的重要前提。

基因載體分病毒載體和非病毒載體兩大類[2]。病毒載體的優(yōu)點(diǎn)是靶基因表達(dá)效率高，但同時也有免疫原性、可能激活原癌基因引發(fā)腫瘤，及難以大量制備等缺點(diǎn)，從而限制了其臨床應(yīng)用。非病毒基因載體的優(yōu)勢在于免疫原性弱，制備方便，對基因材料的要求限制少[3]。非病毒基因載體分為聚合物和脂質(zhì)體兩大類，前者包括聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)、殼聚糖(chitosan)、聚氨基酸(polyamino acid，PAA)、樹枝狀大分子等；后者有陽離子脂質(zhì)體、DNA脂質(zhì)涂層復(fù)合物、類脂質(zhì)體等。非病毒基因載體中的PAA可以被體內(nèi)的酶降解，在器官內(nèi)很少蓄積，是一類非常有應(yīng)用前景的基因載體。PAA中的聚精氨酸(polyarginine，PLR)由于在溶液中帶正電，可以攜帶帶負(fù)電的基因片段跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞中[4]，這一特性讓PLR可用作基因治療的載體。本文綜述了PLR及其衍生物作為基因載體應(yīng)用的研究進(jìn)展。

1 PLR作為基因載體的優(yōu)勢

精氨酸是人體半(條件)必需氨基酸，在生理?xiàng)l件下帶正電荷。PLR由多個精氨酸上的氨基和羧基脫水縮合形成(見圖1)，是一種能夠跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的多肽，PLR和精氨酸可以促進(jìn)藥物穿過細(xì)胞膜，增加進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物比例。精氨酸是細(xì)胞膜穿透肽 (membrane penetrating peptides，MPPs) 中發(fā)揮主要作用的一種氨基酸[5]，也在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域 (protein transduction domains，PTDs) 和HIV Tat蛋白質(zhì)中大量存在。

圖1 聚精氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

在眾多的基因載體材料中，雖然部分材料有較高的基因轉(zhuǎn)染效率，但是這些材料本身不能完全解決免疫原性、生物相容性及體內(nèi)降解性等問題。為了解決這些問題，最好能采用人體自身組成分子，使材料最接近人體的組成?；谶@一思路，氨基酸均聚與共聚材料可以成為潛在的理想基因載體。PLR有很好的生物相容性，毒性較低；易于降解，降解產(chǎn)物為精氨酸，可以被人體利用；體外研究發(fā)現(xiàn)其基因轉(zhuǎn)染的效率較高；價格相對較低，容易制備，通過控制條件合成不同分子質(zhì)量的PLR，給研究和應(yīng)用帶來了極大的便利。

2 PLR作為基因載體應(yīng)用的相關(guān)研究

2.1 PLR進(jìn)入細(xì)胞的途徑 生理?xiàng)l件下PLR分子帶正電，細(xì)胞膜表面有大量帶有負(fù)電的糖蛋白及磷脂，兩者可以通過靜電作用相互吸引結(jié)合，再經(jīng)內(nèi)吞過程進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。Fuchs等[6]研究發(fā)現(xiàn)，PLR的入胞途徑有以下幾步：(1)與細(xì)胞表面的硫酸類肝素(heparan sulfate，HS)結(jié)合，生成硫酸類肝素蛋白質(zhì)多糖(HSPGs)，另外由于PLR帶正電，還可以與細(xì)胞表面帶負(fù)電的糖類結(jié)合；(2)HSPGs通過HS介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用，以囊泡的形式進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)；(3)在囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的過程，HSPGs中的HS被細(xì)胞內(nèi)的類肝素酶水解，釋放出游離PLR；(4)PLR濃度足夠高時，能夠破壞囊泡的雙脂質(zhì)層，從而進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中。

2.2 PLR相對分子質(zhì)量與基因轉(zhuǎn)染效率的關(guān)系 對于聚合物基因載體，相對分子質(zhì)量是影響基因轉(zhuǎn)染效率的重要因素[7，8]。同一類載體的相對分子質(zhì)量越高越容易與基因片段結(jié)合，荷載基因片段的能力越強(qiáng)，但由于高相對分子質(zhì)量載體不易與基因片段解離，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)難以釋放出基因片段，轉(zhuǎn)染效率反而會降低，并且載體的細(xì)胞毒性也與高相對分子質(zhì)量密切相關(guān)。而低相對分子質(zhì)量的基因載體形成的載體-基因片段復(fù)合物在水溶液中容易解體[9]，荷載基因片段的能力不強(qiáng)，也無法達(dá)到較高的轉(zhuǎn)染效率。Hashimoto等[10]研究了聚合度分別為60、180和730的3種PLR，發(fā)現(xiàn)PLR載基因的轉(zhuǎn)染效率與PLR中陽離子基團(tuán)(cationic groups)數(shù)與基因片段中陰離子基團(tuán)(anionic groups)數(shù)之比(C/A)有關(guān)，當(dāng)C/A為6時，3種PLR的轉(zhuǎn)染效率最高；另外，PLR的轉(zhuǎn)染效率與相對分子質(zhì)量有關(guān)，相對分子質(zhì)量越大，基因轉(zhuǎn)染效率越高。因此，要使轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高，需要選擇較高相對分子質(zhì)量的PLR。Koo等[11]利用HEK293細(xì)胞對平均相對分子質(zhì)量分別為1.0×104、4.1×104和8.3×104的3種PLR基因轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量高(4.1×104和8.3×104)PLR的基因轉(zhuǎn)染效率是相對分子質(zhì)量低(1.0×104)PLR的100倍，轉(zhuǎn)染效率與PLR的胍基(N)和基因片段的磷酸基團(tuán)(P)數(shù)量比(N/P)有關(guān)，N/P為10左右時，基因轉(zhuǎn)染效率最高。在細(xì)胞毒性方面，相對分子質(zhì)量高的PLR的毒性比相對分子質(zhì)量低的PLR大，相對分子質(zhì)量為8.3×104和4.1×104的PLR，IC50值分別為70和100 μg/ml，而相對分子質(zhì)量為1.0×104的PLR在濃度為100 μg/ml時未顯示出明顯的細(xì)胞毒性?？傮w來說，PLR載體相對分子質(zhì)量增大后，基因轉(zhuǎn)染效率隨之提高，但細(xì)胞毒性也會增加，PLR作為基因載體應(yīng)用需要選擇合適的相對分子質(zhì)量。

2.3 PLR衍生物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化與應(yīng)用

2.3.1 PLR直接作為基因載體 相對分子質(zhì)量高的PLR由于細(xì)胞毒性較大，不適合直接作為基因載體使用，而相對分子質(zhì)量低的PLR細(xì)胞毒性低，可以直接用作基因載體。Kim等[5]以15聚精氨酸(R15)為siRNA載體，在體外和體內(nèi)進(jìn)行了RNA干擾研究，發(fā)現(xiàn)R15與siRNA可形成穩(wěn)定的復(fù)合物，能夠被體外培養(yǎng)細(xì)胞有效攝取，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，siRNA出現(xiàn)在細(xì)胞核周圍區(qū)域，提示siRNA在胞內(nèi)形成了RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，后者可以阻斷mRNA的翻譯過程。對SKOV-3細(xì)胞移植瘤小鼠瘤內(nèi)注射原癌基因人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor,HER-2)特異性siRNA/肽復(fù)合物，小鼠的腫瘤明顯小于對照組，處理組腫瘤細(xì)胞中的HER-2基因表達(dá)也明顯下降。

D型和L型精氨酸形成的PLR與單一構(gòu)型精氨酸聚合物相比，由于結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，在溶液中近似于球狀，正電荷更多地分布于分子內(nèi)部，分子表面的正電荷數(shù)量減少，從而降低了對細(xì)胞的毒性。Ma等[12]對一系列的D型和L型精氨酸聚合物載體進(jìn)行了研究，單純的L型精氨酸(R)組成的8聚體(R8)細(xì)胞攝取率并不高，但毒性最小。R8中D型精氨酸(r)數(shù)量增加后，細(xì)胞攝取率會有較大提高，但細(xì)胞毒性也隨之提高。R8組成序列為(rR)3R2時，細(xì)胞攝取率較高而毒性較低。D型精氨酸(r)的數(shù)量不超過4個的幾種R8，濃度100 μmol/L時與細(xì)胞孵育12 h后，超過75%的細(xì)胞仍能存活。對小鼠的毒性研究中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。研究者認(rèn)為序列為(rR)3R2的R8是最有潛力的載體。

2.3.2 精氨酸功能化的樹枝狀大分子作為基因載體 聚酰胺胺(polyamidoamine，PAMAM)樹枝狀大分子為第一個合成的樹狀大分子，已廣泛應(yīng)用于基因載體研究，具有轉(zhuǎn)染效率高、毒性低等優(yōu)點(diǎn)。精氨酸和聚酰胺-胺類似，可以通過反應(yīng)形成聚合型的樹枝狀大分子。Luo等[13]應(yīng)用點(diǎn)擊化學(xué)法以精氨酸為基本單元合成了5代(G5A)和6代(G6A)的多肽型樹枝狀大分子，并對其介導(dǎo)的體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染進(jìn)行了研究。該基因載體與質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物粒徑為180～250 nm，載體能有效地保護(hù)質(zhì)粒DNA(pDNA)不被核酸酶降解。對比研究顯示，G5A的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于PEI，G5A/DNA對Hela等8種細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染率高于PEI/DNA，其中對Hela細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染率最高，為PEI/DNA的2.3倍。體內(nèi)研究也有同樣的發(fā)現(xiàn)，荷瘤小鼠腫瘤內(nèi)注射G5A/DNA復(fù)合物，腫瘤中樹枝狀G5A組DNA的表達(dá)為PEI組的6倍。

2.3.3 二硫鍵橋連的PLR作為基因載體 陽離子聚合物載體由二硫鍵橋連后，可以降低載體的細(xì)胞毒性，增加基因轉(zhuǎn)染效率[14]，并且由于二硫鍵在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)很快被酶打開，基因片段的釋放也會加快[3]。為克服相對分子質(zhì)量低的PLR基因轉(zhuǎn)染效率較低的問題，將相對分子質(zhì)量低的PLR分子經(jīng)過二硫鍵橋連后加以克服，同時又能保持較低的細(xì)胞毒性。Won等[15]把兩端為半胱氨酸(Cys)的D型9聚精氨酸[Cys-(D-R9)-Cys]通過分子間氧化合成了二硫鍵橋接的聚精氨酸[poly-(oligo-D-arginine)，rPOA]，數(shù)均(Mn)和質(zhì)均(Mw)相對分子質(zhì)量分別為9.475 7×104和9.620 4×104，rPOA與DNA形成的復(fù)合物，平均粒徑在150 nm左右，N/P為14時Zeta電位15 mV，能保護(hù)復(fù)合物中的DNA不被胎牛血清中的酶降解。體外對照研究顯示，rPOA在H9c2細(xì)胞株中的轉(zhuǎn)染效率要小于PEI，而在HEK293和L2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率與PEI相當(dāng)，均顯著高于相對分子質(zhì)量高的多聚D型精氨酸[poly(D-arginine)，PDR]和D-R9，而且二硫鍵的引入降低了載體的毒性，rPOA的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)小于PEI。體內(nèi)轉(zhuǎn)染熒光素酶DNA的效率方面，rPOA是PEI的20倍，是裸DNA的100倍。Won等[16]又對rPOA進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，siRNA/rPOA>7.5時，rPOA能完全與siRNA縮合；siRNA/rPOA≥5時，rPOA能保護(hù)siRNA不被小鼠血清降解，siRNA/rPOA復(fù)合物平均粒徑為(90.3±2.5) nm，Zeta電位為(36.7±6.4) mV。SCC細(xì)胞對rPOA的攝取率與PEI相當(dāng)，高于PLR，毒性卻小很多。用轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的siRNA(siVEGF)/rPOA處理的SCC細(xì)胞，VEGF的分泌減少了50%，比siVEGF/PEI組還少30%(siVEGF/PEI組VEGF的分泌減少20%)。研究還發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽可促進(jìn)siVEGF/rPOA的降解，這增強(qiáng)了siRNA在細(xì)胞內(nèi)的靶向性。腫瘤內(nèi)注射siVEGF/rPOA能抑制小鼠SCC細(xì)胞皮下移植瘤的生長，移植瘤中的VEGF表達(dá)水平僅為裸siVEGF組的50%。

2.3.4 PLR-硫酸葡聚糖復(fù)合物作為基因載體 硫酸葡聚糖(dextran sulfate)廣泛被用作核酸分子雜交促進(jìn)劑，能夠提高核酸探針的雜交率，PLR經(jīng)硫酸葡聚糖修飾后，可以提高所荷載基因的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染效率。Cho等[17]利用PLR和硫酸葡聚糖組成的復(fù)合物(PLR-DEX)，傳遞表皮生長因子受體(EGFR) siRNA進(jìn)行了治療咽、喉腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究：制備的載體/siRNA復(fù)合物，平均粒徑<200 nm，載體∶siRNA質(zhì)量比為15∶1。經(jīng)共聚焦激光掃描顯微鏡和流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，與PLR/EGFR siRNA復(fù)合物比較，PLR-DEX/EGFR siRNA復(fù)合物中的EGFR siRNA被喉癌細(xì)胞(Hep-2細(xì)胞)和人咽癌細(xì)胞(FaDu細(xì)胞)系攝取率較高，故兩種細(xì)胞系中EGFR基因沉默效率也最高。在FaDu移植瘤小鼠模型中，腫瘤內(nèi)注射PLR-DEX/siEGFR復(fù)合物能抑制腫瘤的生長，移植瘤中EGFR基因表達(dá)也受到抑制。

2.3.5 PLR-透明質(zhì)酸復(fù)合物作為基因載體 透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是天然存在的有黏膜黏附作用的多糖，在體內(nèi)關(guān)節(jié)、眼、肺、小腸等部位大量分布，可被生物降解，在體液中帶負(fù)電荷。HA能與細(xì)胞表面的CD44 受體結(jié)合，在許多上皮來源性腫瘤中CD44 受體表達(dá)上調(diào)[18]，因此，HA可以增強(qiáng)載體的腫瘤靶向作用。當(dāng)帶正電的PLR和帶負(fù)電的HA混合后，兩者會在溶液中形成團(tuán)狀的納米結(jié)構(gòu)，HA可以降低PLR的細(xì)胞毒性。Oyarzun-Ampuero等[19]利用PLR和HA在水溶液中混合制備了球狀的納米粒載體，并對其進(jìn)行了評價：平均粒徑范圍為116～155 nm，Zeta電位與兩者的比例有關(guān)，為(+31.3～-35.9) mV，用相對分子質(zhì)量高的HA和PLR制備的納米粒在生理?xiàng)l件下比較穩(wěn)定，符合作為基因載體的要求。Kim等[20]對PLR和HA物理混合組成的基因載體HP101進(jìn)行了研究，其 HA和PLA的質(zhì)量比(w∶w)為50%∶50%，與單純的PLR相比，HP101對siRNA的傳遞效率增加，siRNA/HP101復(fù)合物對B16F10細(xì)胞的半數(shù)中毒量(TC50值)比siRNA/PLR增加了23倍，細(xì)胞毒性大大降低，而細(xì)胞對兩者及其基因復(fù)合物的攝取率相差不大。在紅色熒光蛋白質(zhì)(red fluorescent protein，RFP)表達(dá)的B16F10細(xì)胞，經(jīng)siRFP/HP101復(fù)合物轉(zhuǎn)染處理后，RFP基因的表達(dá)水平降低了80%；對B16F10細(xì)胞移植瘤內(nèi)注射siRFP/HP101復(fù)合物后，RFP基因在腫瘤組織的表達(dá)減少，并且siRNA在CD44+細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率高于CD44-細(xì)胞，顯示出一定的靶向作用。

2.3.6 mPEG-聚乳酸-b-PLR作為基因載體 聚乙二醇(PEG)具有無毒、無刺激性及良好親水性的特點(diǎn)，能與陽離子聚合物連接以增加后者在血漿中的穩(wěn)定性，降低其毒性，也能避免聚合物被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)清除[21]，但同時也會減少細(xì)胞攝取和內(nèi)涵體逃逸[22]。聚乳酸(polylactic acid，PLA)是乳酸脫水聚合物，可生物降解，有良好的生物相容性，溶于普通溶劑，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[23]，PLA修飾基因載體后可以降低其細(xì)胞毒性。Zhao等[24]合成了聚乙二醇-聚乳酸-b-聚精氨酸(mPEG-PLA-b-R15)基因載體，該載體形成的納米粒粒徑54.3 nm，Zeta電位34.8 mV。mPEG-PLA-b-R15對MCF-7細(xì)胞的毒性要遠(yuǎn)小于PEI和R15，1000 μg/ml的mPEG-PLA-b-R15和R15處理MCF-7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率分別為83.4%和69.9%，而100 μg/ml的PEI處理MCF-7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率為0%，前者顯示出較低的細(xì)胞毒性，這可能與PLA、PLR可以降解和合適的Zeta電位有關(guān)。mPEG-PLA-b-R15與EGFR-siRNA形成的復(fù)合物能使MCF-7細(xì)胞EGFR的表達(dá)減少65%，靜脈注射該復(fù)合物能顯著地抑制荷瘤(MCF-7細(xì)胞)小鼠移植瘤的生長及EGFR的表達(dá)，且裸鼠未發(fā)生固有性免疫應(yīng)答和體重下降現(xiàn)象，表明該載體對裸鼠幾乎沒有毒性。

2.3.7 殼聚糖-PLR作為基因載體 殼聚糖帶正電荷，本身可以作為基因載體，具有生物可降解性和良好生物相容性的特點(diǎn)，還有黏膜黏附和穿透增強(qiáng)的作用，但殼聚糖作為基因載體的缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率比較低[25]。殼聚糖與PLR連接后，既可以降低PLR的細(xì)胞毒性，又能產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)染效率。Noh等[26]把PEG、PLR與殼聚糖相連，制備了一種新型的基因載體，并與殼聚糖、PEG-PLR和殼聚糖-PLR進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)PEG-PLR-殼聚糖對細(xì)胞的毒性比殼聚糖-PLR和PLR低，15 μg/ml的PEG-殼聚糖-PLR/siGL2處理A549細(xì)胞，細(xì)胞存活率為83.5%。殼聚糖與PLR相連后提高了基因的轉(zhuǎn)染效率，殼聚糖-PLR(77.89%)和PEG-PLR-殼聚糖(79.55%)的基因轉(zhuǎn)染效率明顯高于殼聚糖(1.55%)、PEG-殼聚糖(2.67%)和PEG-PLR(2.62%)，也高于PLR(26.19%)。荷瘤(B16F10-RFP細(xì)胞)小鼠腫瘤內(nèi)注射PEG-PLR-殼聚糖/siRFP能明顯降低移植瘤中RFP基因表達(dá)。由此可見，利用PEG和殼聚糖對PLR進(jìn)行修飾可以降低毒性，同時提高基因轉(zhuǎn)染效率。

3 PLR作為基因載體應(yīng)用的前景和所面臨的問題

在基因治療領(lǐng)域，開發(fā)能夠高效、安全傳遞基因進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮作用的載體系統(tǒng)是一個主要研究方向。PLR及其衍生物是一個很有前景的載體系統(tǒng)，大量的體內(nèi)外研究證實(shí)，PLR及其衍生物是合適的非病毒基因載體材料，特別是對PLR結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾優(yōu)化后，保持了其生物相容性和可降解性的優(yōu)點(diǎn)，初步克服了基因轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞毒性大的缺點(diǎn)。雖然各國科學(xué)家在PLR基因載體研究中取得了進(jìn)展，但離實(shí)際應(yīng)用還有一段距離，未來的研究要解決的問題是：(1)降低載體成本，高純度的PLR及其衍生物價格仍然較高，限制了其廣泛應(yīng)用和研究；(2)載體的進(jìn)一步優(yōu)化，以提高載體的轉(zhuǎn)染效率；(3)載體的特性改進(jìn)，根據(jù)需要改善載體材料的性能，如降解時間、基因與載體的解離部位等；(4)載體的靶向性，確保基因片段能在特定的細(xì)胞中發(fā)揮作用，減少對其他細(xì)胞的影響；(5)載體的轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞類型有關(guān)，而目前研究仍限于少數(shù)細(xì)胞系，需要在更多的細(xì)胞系中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。迄今為止，PLR及其衍生物作為基因載體的研究僅在細(xì)胞和動物層面進(jìn)行，離實(shí)際的臨床應(yīng)用還有很長的路要走，相信經(jīng)過研究者不懈的努力，PLR及其衍生物作為基因載體一定會在基因治療中取得長足的進(jìn)展。

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