賀 欣，賀 丹，儲小飛，王海潮，樊賽軍*

(1.中國醫(yī)學科學院和北京協和醫(yī)學院放射醫(yī)學研究所,天津市放射醫(yī)學與分子核醫(yī)學重點實驗室，天津 300192；2.北京大學醫(yī)學部心血管研究所，教育部分子心血管學重點實驗室, 北京100191；3.美國北岸大學醫(yī)院急診醫(yī)學部，紐約11030)

高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)是一種存在于真核生物細胞內的非組蛋白染色體結合蛋白，是一種危險相關分子模式分子，在細胞的生存和死亡過程中發(fā)揮了重要的調節(jié)作用，并參與了包括免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤、糖尿病、阿爾茨海默病以及輻射損傷修復等多種病理狀態(tài)的發(fā)生和進展[1]。鑒于HMGB1的作用廣泛性和基礎性，研究調節(jié)和干擾HMGB1的特異性抑制劑將是基礎和臨床研究都非常感興趣的研究領域。

1 HMGB1的生理和病理功能

人類HMGB1由215個氨基酸組成，相對分子質量為25 ku，含有3個不同的結構域：兩個結構相似但是功能不同的串聯同源結構域Box A和Box B，以及一個酸性C末端。

1999年，Wang等[2]首次發(fā)現HMGB1是炎癥進展過程中一種重要的細胞外介質。隨后大量研究揭示，HMGB1可通過簡單擴散、被動釋放和主動分泌的形式釋放到胞外基質，并且可與多種受體高親和力結合，如DNA、核小體、IL-1β、脂多糖(lypopolysaccharide)和磷脂壁酸等，從而介導多種生理功能或病理的進展(圖1)，參與了多種慢性炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)病機制，在多數炎癥性疾病，如膿毒癥、類風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、慢性腎病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)，以及腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉移中都可以檢測到血清HMGB1高水平表達。此外，HMGB1也參與了一些以細胞死亡和損傷為主要特征的疾病，如糖尿病和阿爾茨海默病。

圖1 HMGB1是一種多功能調節(jié)因子

2 調節(jié)HMGB1的藥物及對相關疾病的療效

2.1 可與糖化終末產物受體相互作用的HMGB1拮抗劑 糖化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)是一個模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)，類似于天然免疫受體，如Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)。HMGB1活化的RAGE參與了包括膿毒癥、糖尿病、阿爾茨海默病和腫瘤在內的多種病理進展。抑制HMGB1-RAGE相互作用是一個調節(jié)炎癥、控制腫瘤進展和轉移的可行方案。有研究表明，抑制HMGB1-RAGE通路能有效地抑制肺癌的生長和轉移。抑制HMGB1-RAGE信號傳導的有效方法之一是利用HMGB1的拮抗劑發(fā)揮作用。重組Box A是HMGB1的特異性拮抗劑，可以有效地與RAGE相互作用，競爭性抑制HMGB1與RAGE的相互作用(圖2)。同時，Box A由于缺乏位于Box B的促炎細胞因子活性，可不激活RAGE受體而發(fā)揮抗炎作用。體內和體外實驗證實，將Box A通過(Gly4Ser)3序列與酸性的羧基端融合，能增強其抗炎活性。

圖2 HMGB1的結構及相關功能區(qū)域示意圖

此外，有3種S100P來源的短肽通過抑制NF-κB的活性，也可阻斷RAGE介導的信號傳導。其中最有效的短肽在微摩爾濃度下即可抑制S100P、S100A4和HMGB-1與RAGE的相互作用，進而在體內及體外水平上降低癌細胞內NF-κB的活化。在體內實驗中，這種短肽有抑制神經膠質瘤生長、抑制胰腺腫瘤細胞生長及轉移的作用[3]。

2.2 HMGB1的小分子抑制劑

2.2.1 天然來源的HMGB1的小分子抑制劑 一種來源于光果甘草根莖部的三萜烯——甘草皂苷具有抗炎癥和抗病毒的特性。甘草皂苷可以直接與兩個HMG Box結構域結合[解離常數(Kd)≈150 μmol/L]，抑制它的化學誘導物和促有絲分裂的活性。對甘草皂苷在一系列HMGB1相關疾病中發(fā)揮活性的機制研究表明，甘草皂苷可通過抑制細胞外的HMGB1細胞因子活性，從而降低動物脊髓、肝臟、大腦和心肌的缺血-再灌注損傷[4,5]。甘草皂苷也有助于腦內出血的治療[6]，減輕皮層損傷。在急性腦缺血損傷中，HMGB1對腦缺血損傷進展發(fā)揮了關鍵作用。甘草皂苷可通過抑制HMGB1的分泌發(fā)揮抗炎和神經保護作用。進一步研究表明，甘草皂苷可以在腦缺血后及脂多糖處理的巨噬細胞中濃度依賴性地抑制HMGB1磷酸化(促HMGB1分泌信號之一)來阻斷HMGB1的分泌[7]。甘草皂苷可通過降低炎癥細胞因子水平、抑制HMGB1的釋放來發(fā)揮對大鼠脊髓缺血性損傷的保護作用，可通過直接抑制細胞外HMGB1細胞因子活性、阻斷磷酸化JNK/Bax信號通路，減輕大鼠缺血-再灌注導致的心肌細胞損傷[8]。

在抗癌治療中，甘草皂苷與其他藥物合用可顯著提高治療效果。由于HMGB1可刺激癌細胞生長、促進內皮細胞增殖、促進血管新生及細胞運動、誘導炎癥反應，因此HMGB1的釋放不利于腫瘤的治療，且能促進腫瘤細胞再生長。甘草皂苷可以阻斷HMGB1誘導的細胞增殖和遷移過程，抑制HMGB1誘導的血管新生，降低炎癥水平(降低TNF-α水平)，抑制小鼠腫瘤再生長。因此，將甘草皂苷與促進腫瘤細胞壞死的藥物或其他HMGB1抑制劑聯合給藥，有望產生更理想的治療效果。

甘草皂苷對敗血癥也有一定的改善作用。它可維持體循環(huán)血流動力學的穩(wěn)定性，保護重要器官不受脂多糖誘導的內毒素血癥所侵害。這一作用主要是通過降低血清中HMGB1及其他促炎細胞因子水平及其基因表達，進而調控系統(tǒng)性炎癥反應[9]。

此外，5%甘草皂苷及其共聚物(乙二醇或丙二醇)制備的溶液型滴眼劑在健康志愿者的臨床試驗中耐受性良好，未發(fā)現有毒性作用。在中度到重度瞼炎感染的病人中，應用此懸浮滴劑后抗炎效果明顯[10]。近期發(fā)現，一些新型的具有甘草皂苷C-30殘基的衍生物具有HMGB1抑制劑特性，在提高慢性和急性心力衰竭小鼠生存率方面具有與甘草皂苷復合物類似的效應[11]。作為另一種人工合成的甘草皂苷衍生物，甘珀酸(carbenoxolone)可以劑量依賴性地阻斷內毒素誘導的巨噬細胞HMGB1釋放，這一過程可能是通過抑制蛋白激酶R(protein kinase R，PKR)的激活而實現的，同時也支持了PKR參與HMGB1釋放的假說[12]。

黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ，AST Ⅳ)作為中藥黃芪的主要有效成分，已證實具有抗炎和增強免疫力等作用。體外實驗表明，不同劑量AST Ⅳ對HMGB1介導的小鼠調節(jié)性T細胞免疫功能具有劑量依賴性的拮抗作用，對HMGB1介導的促炎效應有顯著抑制作用[13]。

一些類固醇類似物，如丹參酮(tanshinone)Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮等是從中藥丹參中提取出來的色素成分，也可劑量依賴性地降低巨噬/單核細胞中內毒素誘導的HMGB1的釋放。其中,丹參酮ⅡA的水溶性磺酸鈉衍生物可以通過選擇性地阻斷內毒素誘導的HMGB1胞質易位和釋放，對致死性內毒素血癥和敗血癥小鼠產生保護作用。該衍生物可刺激外源的HMGB1蛋白通過巨噬細胞胞質囊泡轉移進入細胞內，繼而通過將其轉移至LC3陽性液泡中進行降解，這一過程有溶酶體的參與[14]。

一些天然復合物，如兒茶素-3-五倍子酸鹽、槲皮黃酮和番茄紅素也可以降低內毒素血癥引起的致死性系統(tǒng)性炎癥。從植物山茶花葉子中提取的兒茶素-3-五倍子酸鹽是綠茶的主要成分，對患致死性內毒素血癥和敗血癥小鼠有保護作用。該保護作用主要通過以下機制實現：(1) 降低巨噬/單核細胞中HMGB1的累積和釋放；(2) 對HMGB1介導的炎癥反應關鍵環(huán)節(jié)之一的外源性HMGB1在巨噬細胞表面聚集，產生阻止作用。槲皮黃酮是在水果、蔬菜、葉子和谷物中廣泛存在的一種植物類黃酮，可降低患內毒素血癥動物體內的HMGB1水平。在巨噬細胞中，槲皮黃酮可以抑制HMGB1的釋放和細胞因子活性，抑制促分裂原活化蛋白激酶的活性[15]。番茄紅素(lycopene)是在番茄和紅果中發(fā)現的一種類胡蘿卜素，具有抗氧化、抗癌和抗炎特性，可抑制內皮細胞中LPS介導的HMGB1的釋放，HMGB1介導的TNF促分泌的磷脂酶A2的表達，以及HMGB1介導的促炎信號傳導過程。這些效應是通過下調細胞黏附分子(cell adhesion molecules，CAMs)和HMGB1受體，TLR-2、TLR-4和RAGE等在細胞表面的表達來實現的[16]。小檗堿通過抑制HMGB1基因表達抑制巨噬細胞釋放HMGB1[17]。中藥復方的研究發(fā)現，清熱化瘀中藥復方——清肝方能降低急性肝衰竭大鼠肝組織中HMGB1的表達，對急性肝衰竭大鼠起到保護作用[18]。

2.2.2 人工合成的HMGB1的小分子抑制劑 幾種合成分子，如甲磺酸萘莫司他、甲磺酸加貝酯(gabexate mesilate)和西維來司鈉可通過抑制HMGB1來部分降低脂多糖誘導的肺部損傷。甲磺酸萘莫司他、甲磺酸加貝酯是兩種合成的蛋白酶抑制劑，可通過阻斷脂多糖誘導后細胞因子的釋放來抑制HMGB1的表達[19]。西維來司鈉是中性白細胞彈性蛋白酶高度特異性的合成抑制劑，在急性肺損傷中可抑制NF-κB的活化。

兩種他汀類藥物分子阿托伐他汀和辛伐他汀，可以下調HMGB1-RAGE水平。在大鼠大腦中動脈閉塞之后，阿托伐他汀可通過抑制HMGB1、RAGE、TLR-4和NF-κB的過表達而保護大鼠免受缺血性損傷[20]。在ApoE-/-基因敲除小鼠中，辛伐他汀可顯著降低血管炎癥及動脈粥樣硬化病變面積，降低主動脈中HMGB1、RAGE、血管內皮細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的表達。瑞舒伐他汀能降低高血脂病人血清HMGB1水平[21]。

有研究結果表明，丙酮酸乙酯在慢性結腸炎中可作為HMGB1的有效抑制劑發(fā)揮良好的治療效果。此外在胃癌治療中其也可發(fā)揮抗腫瘤的作用。在患有慢性結腸炎的IL-10基因敲除小鼠中，小腸的HMGB1的表達量升高，丙酮酸乙酯可抑制結腸炎癥和腸道細胞因子的產生，進而降低HMGB1的水平。丙酮酸乙酯可抑制重癥急性胰腺炎大鼠HMGB1的表達。此外，丙酮酸乙酯還可抑制HMGB1從細胞核到細胞質的易位過程。丙酮酸乙酯亦可通過下調HMGB1基因并抑制蛋白質表達，對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷發(fā)揮保護作用[22]。其他研究表明，丙酮酸乙酯可通過下調HMGB1-RAGE表達水平抑制膽囊腫瘤細胞的生長和侵襲。丙酮酸乙酯可降低HMGB1、RAGE、增生細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和基質金屬蛋白酶-9的表達，抑制膽囊癌細胞增殖和遷移，誘導體內膽囊癌細胞的凋亡和S期細胞周期停滯[23]。此外，丙酮酸乙酯對胃癌細胞生長也有抑制作用，主要通過調節(jié)HMGB1-RAGE和Akt信號通路實現。以上研究結果表明，丙酮酸乙酯和其他治療藥物聯合治療癌癥有良好的應用前景[24]。

順鉑是臨床抗腫瘤的重要化學治療藥物，最新研究發(fā)現，無論在體外還是體內實驗，順鉑可增加細胞核HMGB1水平，降低細胞質HMGB1水平，抑制HMGB1從細胞核到細胞質的轉運和向細胞外環(huán)境釋放。順鉑可有效防止急性肝衰竭，其作用機制目前了解不多，有推測認為順鉑與DNA和HMGB1形成螯合物，阻止HMGB1的移位和釋放[25]。

一氧化碳(CO)是重要氣體信使，參與了膿毒癥相關的炎癥反應、脂質過氧化損傷、缺血-再灌注損傷、膿毒癥性休克等生理病理過程，介導抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用。外源性一氧化碳釋放分子(extrinsic carbon monoxide releasing molecule 2, CORM-2)能夠下調膿毒癥大鼠肺組織中HMGB1的表達，減輕膿毒癥肺損傷[26]。

此外，有研究表明，HMGB1與甲氨蝶呤有直接的相互作用。甲氨蝶呤是臨床上用于腫瘤化療和治療包括類風濕性關節(jié)炎在內的一些自身免疫性疾病的具有抗炎特性的藥物。甲氨蝶呤在HMGB1上有兩個獨立的結合位點，即Al區(qū)(G1-K87)和Bj區(qū)(F88-K181)。甲氨蝶呤在Al區(qū)和Bj區(qū)的解離常數分別是0.50 μmol/L和0.24 μmol/L。甲氨蝶呤在Bj區(qū)的結合域包含了RAGE在HMGB1上的結合域(K149-V175)，從而可在分子和細胞水平上抑制HMGB1-RAGE 的相互作用，這一結構特征對甲氨蝶呤發(fā)揮抗炎特性尤為重要[27]。

2.3 HMGB1抗體 抗HMGB1的抗體主要用于確認HMGB1是否參與到了某些疾病的病理過程中，也用于衡量HMGB1抑制劑的功效?？笻MGB-1(或抗Box A蛋白)的多克隆抗體經過全身用藥可以顯著抑制膠原誘導的關節(jié)炎的炎癥和組織破壞，這提示HMGB1抑制劑或可成為治療關節(jié)炎的有效藥物。此外，有研究發(fā)現，抗HMGB1的單克隆抗體(2G7, 鼠源IgG2b)可在DBA/1小鼠Ⅱ型膠原誘導型關節(jié)炎，以及由特定基因缺陷產生的慢性、自發(fā)性、多發(fā)性關節(jié)炎這兩種不同類型的關節(jié)炎中發(fā)揮良好的緩解病情效果。通過組織學檢查發(fā)現，抗HMGB1的單克隆抗體治療方法可在一定程度上預防關節(jié)破壞?？笻MGB1的單克隆抗體對于這兩種關節(jié)炎的良好治療效果也進一步印證了HMGB1可能成為相關疾病臨床治療中一個有效的分子靶點[28]。

完全人源化的單克隆抗體(IA-4，可同時識別鼠源和人源的HMGB1)可抑制重組HMGB1誘導的IL-6在外周單個核細胞中的分泌，表明HMGB1是狼瘡性腎炎中一個關鍵的效應分子，抗HMGB1的治療方法對于SLE的治療同樣有良好的應用前景[29]。

2.4 HMGB1的多肽和蛋白質抑制劑 一些內源性神經多肽具有抑制HMGB1的活性，能夠提高內毒素血癥動物生存率，特別是血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)和尿皮素(urocortin)兩個廣為人知的抗炎多肽，體內外實驗均證實，它們可廣泛調節(jié)炎癥因子，下調HMGB1從細胞核向細胞質易位，阻止其向胞外釋放。VIP和尿皮素分別可以提高致死性膿毒癥動物生存率，但重組HMGB1可完全逆轉該作用。此外，垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP)是一種內源性神經肽，它能顯著減少血液HMGB1水平并提高致死性內毒素血癥動物的生存率。體外實驗證實，PACAP可抑制脂多糖誘導的巨噬細胞/單核細胞的HMGB1釋放，以及TNF-α和IFN-γ誘導的HMGB1釋放。此外，體內外實驗證實，PACAP可抑制HMGB1誘導的細胞因子的釋放。

由于凝血級聯反應在炎癥過程中發(fā)揮關鍵作用，許多研究小組研究了重組血栓調節(jié)蛋白對內毒素血癥的治療效果?？扇苄灾亟M人血栓調節(jié)蛋白(recombinant human thrombomodulin，rTM)在脂多糖誘導的內毒素血癥大鼠模型中表現出抑制炎性因子表達，降低血漿HMGB1水平，即使延遲給藥，也能顯著減少肝功能障礙，降低死亡率[30]。另一項研究報道了rTM在嚙齒動物膿毒癥模型中的體內和體外效果[31]。在脂多糖誘導的大鼠全身炎癥反應模型，rTM抑制肺組織的促炎因子和HMGB1的釋放，明顯減輕肺損傷，如間隙充血、水腫、炎癥和出血。此外，體外實驗顯示，rTM可通過抑制I-κB磷酸化而抑制NF-κB活化。因此，抗凝血藥物rTM可作為全身性、炎癥性疾病的有效治療藥物。

蝎素組分Ⅲ是從河南馬氏鉗蝎素中分離純化出來的一種活性成分[32]，它可以刺激或抑制THP1細胞HMGB1的表達，其作用效果與劑量密切相關。

2.5 HMGB1的寡核苷酸抑制劑 由于細胞核內的HMGB1可結合并導致DNA雙鏈彎曲，同時，HMGB1能夠識別DNA結構扭曲并與之高親和力結合。因此，DNA可以作為HMGB1活性的有效調節(jié)配體。設計合成扭曲的DNA，提高其與HMGB1的結合活性。在初步研究中，Chim2A顯著降低內毒素血癥小鼠死亡率。但是，所有DNA類HMGB1抑制劑的熱穩(wěn)定性差[熔點(Tm)約37 ℃]，限制了對此類藥物的進一步研究。為了提高扭結雙鏈DNA的酶耐受能力和熱穩(wěn)定性，Musumeci等[33]合成一個發(fā)夾環(huán)雙鏈DNA，類似Chim2A的單分子雙螺旋。該化合物含有未成對腺嘌呤扭結，同時由額外的3個腺嘌呤連接兩個互補鏈形成環(huán)狀。

使用天然核苷酸形成發(fā)夾環(huán)，可以避免化學修飾的潛在毒性?；衔?比2A雙體的熱穩(wěn)定性和酶耐受能力大幅度提高，與HMGB1蛋白質的作用效果也通過BIA實驗得到證實。進而，DNA雙螺旋類似物能夠劑量依賴性抑制蛋白誘導的細胞遷徙，IC50<1 nmol/L，比已知的HMGB1抑制劑甘草酸降低3個數量級。另一種較為成功的改造是：在自然發(fā)夾結構DNA的5′端和成環(huán)的位置插入寡聚乙二醇間隔物，以提高酶的穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性，以及它的整體藥動學性質。熱穩(wěn)定性數據(Tm=66 ℃)和活性(IC50在nmol/L級)證實ODN可能是目前已知的HMGB1抑制劑的最優(yōu)候選。生物穩(wěn)定性分析為進一步的體內實驗研究提供了積極的結果[33]。

3 展 望

HMGB1參與包括敗血癥、風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、慢性腎病、SLE、癌癥等慢性炎癥與自身免疫性疾病的發(fā)病機制。目前通過采用RAGE結合的HMGB1競爭性拮抗劑(如重組的HMGB1的Box A功能域或S100P衍生的RAGE肽)，天然/合成的小分子HMGB1特異性抑制劑(如甘草皂苷或甲磺酸加貝酯)，以及生物來源物質(如HMGB1的特異性抗體、多肽、蛋白質或彎曲的DNA based雙鏈)等多種策略，在控制HMGB1及其誘導的相關疾病都已取得了令人鼓舞的研究結果。另外，目前關于HMGB1抑制劑的最新研究進展不包括Selex方法篩選出的抗HMGB1適體(aptamers)，此類適體具有高度活性和優(yōu)異的選擇性，這一新興研究領域將會被深入研究。

由于HMGB1本身參與了基本上所有病理生理過程，已發(fā)現眾多活性物質通過阻止HMGB1的合成、釋放并降低其活性等，從多種層面發(fā)揮HMGB1抑制劑的功能[34]，因此，HMGB1抑制劑的臨床應用范圍也非常廣泛。將HMGB1作為靶蛋白的抑制劑的深入研究也為HMGB1相關疾病和炎癥損傷的防治提供了新的研究方向，特別是在腫瘤治療方面，阻斷HMGB1的釋放抑制劑與放化療的聯合應用是否可以更有效地提高腫瘤放化療的療效? 是否出現腫瘤類型的差異？抑制劑是否通過阻斷HMGB1誘導的炎癥，降低放化療所產生的正常組織和器官損傷，從而達到保護正常組織和器官的效果？這些問題的深入研究勢必為HMGB1在臨床上作為重要的靶點提供全新的研究領域和課題。

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