李文娟，李任武，吳茂誠，王傅喆，秦麗萍，李 柏，胡宏崗 (.煙臺大學(xué)藥學(xué)院，山東 煙臺 264005；2.第二軍醫(yī)大學(xué)，a.藥學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室，b.長海醫(yī)院中醫(yī)系，上海 200433)

蜂毒作為一味傳統(tǒng)中藥用于治療疾病由來已久，對自身免疫性疾病亦有較好的療效。蜂毒素作為蜂毒主要組成成分越來越受到人們的重視。近年來，有關(guān)蜂毒及其蜂毒素抗腫瘤的機(jī)制研究取得了新進(jìn)展[1, 2]。國外早有研究報(bào)道認(rèn)為，蜂毒素能夠影響多種細(xì)胞信號通路，可能是一種新型抗腫瘤先導(dǎo)化合物[3, 4]。蜂毒素由26個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成, 氨基酸殘基組成為: Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2, 相對分子質(zhì)量為2 846 u。國內(nèi)外有關(guān)蜂毒素的全合成途徑未曾有文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室首次通過固相逐步合成法對直鏈二十六肽蜂毒素的合成工藝進(jìn)行研究。

1 儀器和試劑

1.1儀器 恒溫磁力攪拌器(上海志威電器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(LOOYE ZX98-1);水浴鍋(LOOYE ZX98-1) ;2ZX-4型旋片真空泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司) ;低溫冷卻循環(huán)泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司);循環(huán)水式多用真空泵SHB-IIIA(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司); ZF7B三用紫外分析儀(上海康化生化儀器制造廠)。

1.2試劑 Fmoc-氨基酸、Wang樹脂、N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1-羥基苯并三氮唑( HOBt )、三氟乙酸( TFA)、N,N-二異丙基乙基胺( DIPEA )、三氟乙醇(TFE)均 購自上海吉爾生化有限公司；茚三酮、哌啶、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷( DCM)、N-甲基吡咯烷酮( NMP )均為市售分析純試劑；乙腈為色譜純(J﹠K)。

2 合成實(shí)驗(yàn)

2.1蜂毒素的固相逐步合成 蜂毒素的化學(xué)合成采用Fmoc固相合成法，由羧基端向氨基端方向合成。合成工藝如下：將0.5 g Wang 樹脂(0.8 mmol/g)、Fmoc-氨基酸、DIPEA(0.6 mmol)、DCM(20 ml)加入到多肽固相合成反應(yīng)器中, 振蕩反應(yīng)2 h，隨后用10 ml 哌啶:DMF(1:4)脫除氨基保護(hù)基Fmoc。隨后，依次將樹脂和下一氨基酸的活化酯進(jìn)行反應(yīng)，使用的活化試劑為HOBt/DCC(1.2 mmol/ 1.2 mmol)，反應(yīng)溶劑為NMP(10ml)、DCM(10 ml)，室溫下震蕩反應(yīng)?？s合過程中采用茚三酮定性顯色監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。使用切割試劑(TFA-DCM=(19:1)(V/V) 將目標(biāo)多肽從樹脂上裂解下來，同時(shí)除去側(cè)鏈保護(hù)基。溶液經(jīng)濃縮后即得到蜂毒素粗品。

2.2蜂毒素的分析純化

2.2.1蜂毒素粗品的純化 蜂毒素粗品通過反相制備液相進(jìn)行純化。色譜條件：島津公司LC-6A制備液相色譜儀。色譜柱：ODS C18柱(20 mm×250 mm, 5 μm)。流動相A為0.1% TFA/水，流動相B為0.1%TFA/乙腈，梯度洗脫：20%B(25 min)→80%B(5 min)→100%B(5 min)，流速10 ml/min，檢測波長220 nm, 進(jìn)樣量200 μl。凍干后得到的純品為白色固體粉末，收率為32%。HR-Q-TOF-MS：m/q[M+4H+] /4 712.450 5。

2.2.2蜂毒素粗品的HPLC純度測定 蜂毒素粗品經(jīng)純化后，分析終產(chǎn)物的純度。色譜條件：SPD-M20A型高效液相色譜儀(日本島津公司) 。色譜柱: ODS C18柱( 4.6 mm×150 mm, 5 μm, 100 A, Hypersil)。流動相A為0.1% TFA/水，流動相B為0.1%TFA/乙腈，梯度洗脫20%B(25 min)→80%B(5 min)→100%B(5 min), 流速1 ml/min，檢測波長220 nm, 進(jìn)樣量20 μl。經(jīng)測定，本法所制備蜂毒素的純度>97 %(圖1)。

圖1 蜂毒素RP-HPLC純度檢測

3 結(jié)果與討論

3.1樹脂的選擇 固相合成主要基于：所要合成肽鏈的未端氨基酸的羥基以共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)同一個(gè)不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上氨基酸作為氨基組分，經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基，并同過量的活化羥基組分反應(yīng)接長肽鏈。重復(fù)操作(縮合→洗滌→去保護(hù)→中和、洗滌→下一輪縮合)，達(dá)到所要合成的肽鏈長度；最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。將固相合成與其他技術(shù)分開來的唯一特征是固相載體。固相載體并不是萬能的，需根據(jù)實(shí)際情況選擇使用。本實(shí)驗(yàn)在蜂毒素的合成中采用了Wang樹脂。該樹脂滿足了以下條件：首先，肽鏈和樹脂的反應(yīng)位點(diǎn)最終可以形成蜂毒素中的酰胺結(jié)構(gòu)；其次，Wang樹脂對合成過程中的物理和化學(xué)條件穩(wěn)定，而且可以在不斷增長的肽鏈和試劑之間快速、不受阻礙地接觸。

3.2縮合劑的使用 常用的氨基酸縮合體系有DCC-HOBt、DIC-HOBt、HATU-DIPEA、HBTU-DIPEA、PyBOP-DIPEA等。本實(shí)驗(yàn)中，筆者選擇DCC-HOBt體系進(jìn)行氨基酸縮合，主要基于以下兩點(diǎn)理由：首先，DCC是一種廉價(jià)的縮合劑，易溶于有機(jī)溶劑，可使氨基酸在短時(shí)間內(nèi)完成縮合；其次，DCC縮合的副產(chǎn)物DCU不溶于反應(yīng)溶劑，易通過過濾除去。

3.3側(cè)鏈保護(hù)基的除去 本研究選擇了不同比例的TFA-DCM溶液(25%、50%、75%和90%)對樹脂上的蜂毒素進(jìn)行游離和保護(hù)基的脫除，最終確定了90%TFA-DCM溶液的樹脂游離和保護(hù)基脫除體系。在此條件下，不僅能將多肽直接從樹脂上切下，并同時(shí)將側(cè)鏈保護(hù)基完全脫除。

4 結(jié)論

研究蜂毒素固相合成方法，它以Wang樹脂為固相載體；HOBt/DCC 為縮合劑； NMP/DCM為反應(yīng)溶劑；肽鏈從樹脂上切下后采用90%TFA除去側(cè)鏈保護(hù)基。該條件下合成的蜂毒素, 收率達(dá)32%，通過RP-HPLC分析其純度>97%，能夠滿足藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究所需。本合成方法具有可行性, 操作簡便、總收率高等特點(diǎn)，適用于各種長鏈多肽的合成。

【參考文獻(xiàn)】

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[2] 高啟龍, 李寒冰, 姚亞民, 等. 蜂毒素(Mel)對裸鼠骨肉瘤的抑制作用與影響腫瘤血管生成、細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)系[J]. 復(fù)旦學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2012, 39 (03): 283-288.

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