曾甜甜，盧小東，陳路芳，陳園園，邵啟祥

（江蘇大學基礎醫(yī)學與醫(yī)學技術學院，江蘇鎮(zhèn)江212003）

伏馬霉素通過上調(diào)TGF-β信號通路促進HepG2細胞增殖

曾甜甜，盧小東，陳路芳，陳園園，邵啟祥

（江蘇大學基礎醫(yī)學與醫(yī)學技術學院，江蘇鎮(zhèn)江212003）

目的：研究伏馬霉素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）對人肝癌HepG2細胞株增殖的作用及相關機制。方法：人肝癌HepG2細胞株接種至培養(yǎng)皿，分別設0、0.5、1.0、10、50μmol／L伏馬霉素濃度的DMEM培養(yǎng)液，處理48 h后，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況并計數(shù)。在此基礎上，通過CCK-8實驗觀察FB1對細胞增殖的影響，實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、Smad4（Drosophila mothers against decapentaplegic 4，Smad4）、纖溶酶原激活物抑制物1（plasminogen activator inhibitor1，PAI-1）mRNA的表達。結果：FB1作用后，倒置顯微鏡下觀察HepG2細胞有絲分裂象明顯增加；CCK-8實驗結果顯示，不同濃度FB1處理48 h后，HepG2細胞增殖隨FB1濃度的增加而增加，呈劑量依賴性。實時定量PCR結果顯示，與對照組相比，10μmol／L組和50μmol／L組Smad4，PAI-1mRNA表達均顯著上調(diào)，而0.5μmol／L組和1.0μmol／L組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義；各濃度組TGF-β1mRNA均較對照組顯著上調(diào)。結論：FB1可以有效促進HepG2細胞增殖，其機制可能與上調(diào)TGF-β1，Smad4，PAI-1mRNA表達，即TGF-β信號通路有關。

伏馬霉素；細胞增殖；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；信號通路；HepG2細胞

伏馬霉素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）是一種由串珠鐮刀菌（Fusarium verticillioides）污染玉米和玉米食品產(chǎn)生的真菌毒素［1］。伏馬霉素不僅可以引起豬肺水腫綜合征、馬腦白質(zhì)軟化癥和鼠肝腎損傷，還可對其他畜禽及實驗動物造成多種毒性作用進而誘發(fā)腫瘤，而且與人類食管癌、肝癌的發(fā)生也有著非常密切的關系［2－3］。伏馬霉素主要通過抑制神經(jīng)鞘氨醇的生物合成，阻礙鞘脂類代謝，進而誘發(fā)肝癌、食管癌［4］。

現(xiàn)已知伏馬霉素可誘導多種細胞凋亡，對人、動物具有潛在的致癌作用，但具體致癌機制目前還不明確［5］。近來研究發(fā)現(xiàn)，伏馬霉素在一定條件下可促進細胞增殖，可能為其又一致癌機制［6］。本實驗將伏馬霉素作用于人肝癌HepG2細胞，觀察其促進細胞增殖的情況，同時測定TGF-β信號通路相關蛋白轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、Smad4（Drosophila mothers against decapentaplegic protein4，Smad4）、纖溶酶原激活物抑制物1（plasminogen activator inhibitor1，PAI-1）mRNA表達水平，以進一步探討伏馬霉素誘導癌癥發(fā)生的機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與材料

人肝癌HepG2細胞株由本室提供；伏馬霉素購自Enzo Life Sciences公司；小牛血清購自杭州四季青公司；細胞計數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit8，CCK8）購自碧云天生物研究公司；Trizol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購買自大連TaKaRa公司；RT-PCR涉及的引物均由上海Invitrogen有限公司設計；MQX200酶標儀購自Gene公司；AXIO Observer A1型光學顯微鏡為Carl Zeiss公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人肝癌細胞株HepG2的培養(yǎng) 用含10%小牛血清，100 U／L青霉素，100 mg／L鏈霉素的DMEM于37℃，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞株。細胞呈貼壁成長，選擇對數(shù)生長期的細胞，隨機分為對照組和處理組。

1.2.2 伏馬霉素處理HepG2細胞 將對數(shù)生長期人肝癌HepG2細胞株分別接種于6孔（105／孔）、96孔（104／孔）培養(yǎng)板，37℃，5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h，分別設0、0.5、1.0、10、50μmol／L伏馬霉素濃度的DMEM，培養(yǎng)液處理48 h后，繼續(xù)進行下一步實驗。

1.2.3 伏馬霉素處理后細胞增殖狀態(tài)觀察 伏馬霉素處理48 h后，取接種于96孔培養(yǎng)板的HepG2細胞于光學顯微鏡下觀察生長狀態(tài)，并拍照。

1.2.4 CCK-8法測定細胞增殖 取對數(shù)生長期的HepG2細胞株，分別接種于96孔板中，104／孔，培養(yǎng)24 h；取伏馬霉素濃度為0、0.5、1.0、10、50μmol／L的系列培養(yǎng)基各100μL，分別加入對應的孔，其中0 μmol／L為陰性對照組，同時設立空白孔（含培養(yǎng)基不含藥物與細胞）進行校正，每組樣本3個復孔。培養(yǎng)48 h后，于對應的孔加入CCK-8試劑10μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標儀450 nm波長下檢測各孔的光密度（D）值。

1.2.5 實時熒光定量PCR測定TGF-β信號通路相關基因 人肝癌HepG2細胞株經(jīng)0、0.5、1.0、10、50 μmol／L濃度伏馬霉素處理48 h后，棄培養(yǎng)基，加入Trizol試劑，提取總RNA。用紫外分光光度計測定RNA濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應體系：總RNA 500 ng，5×反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應緩沖液2μL，去RNA酶蒸餾水補足至10μL；反應條件：37℃15 min，85℃5 s，4℃保存。以合成的cDNA進行熒光定量PCR。反應體系：樣品cDNA 1.5μL、上下游引物各0.5μL、實時熒光定量反應混合液5μL、雙蒸水2.5μL，總體積為10μL；反應條件：95℃30 s，95℃5 s，GAPDH 60℃（TGF-β1 56℃，Smad4 59℃，PAI-1 58℃）10 s，72℃30 s，40個循環(huán)后制作熔解曲線。實驗結果以公式2－ΔΔCt進行處理，以GAPDH為內(nèi)參照，以未加藥組基因的mRNA相對表達量為1.0，定量分析各處理組基因mRNA的相對表達水平。各基因引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0軟件進行多組間均數(shù)比較與單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 伏馬霉素對人肝癌細胞HepG2分裂和增殖的影響

不同濃度伏馬霉素處理HepG2細胞48 h后，呈分裂象的細胞數(shù)明顯增加，與陰性對照組相比，0.5 μmol／L組、1.0μmol／L組有絲分裂像細胞差異無統(tǒng)計學意義，而10μmol／L、50μmol／L處理組分裂像細胞明顯增加，并呈劑量依賴性。與陰性對照組相比，0.5μmol／L組、1.0μmol／L組細胞增殖速度無明顯變化（P均＞0.05），而10μmol／L、50μmol／L組細胞增殖速度明顯增加（P均＜0.05），且呈劑量依賴性。見圖1～2。

圖1 不同濃度伏馬霉素對HepG2細胞分裂數(shù)的影響

圖2 不同濃度伏馬霉素對HepG2細胞增殖的影響

2.2 伏馬霉素對TGF-β信號通路的影響

用不同濃度伏馬霉素處理人肝癌HepG2細胞48 h后，與陰性對照組相比，各濃度處理組TGF-βmRNA表達均顯著上調(diào)，且呈劑量依賴性（F＝42.91，P＜0.05）。同樣，與陰性對照組相比，各濃度處理組Smad4、PAI-1 mRNA表達水平皆顯著上調(diào)（Smad4：F＝28.95，P＜0.000 1；PAI-1：F＝33.86，P＜0.000 1），其中0.5μmol／L組、1.0 μmol／L組Smad4 mRNA水平和0.5μmol／L組PAI-1 mRNA水平與陰性對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義，其余組別與陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。見圖3。

3 討論

自1988年首次分離出伏馬霉素后，其毒性在人畜體內(nèi)、體外實驗中陸續(xù)得到證實［7］。玉米中伏馬霉素的污染現(xiàn)象在全球非常普遍，且常與其他致癌性霉菌毒素（如黃曲霉毒素、雜色曲霉素及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等）混合污染［8］。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外某些地區(qū)食管癌發(fā)病率與當?shù)丶Z食中伏馬霉素的污染情況成正相關，且動物實驗結果表明，伏馬霉素可誘發(fā)某些嚙齒類動物肝臟及腎臟腫瘤的發(fā)生［9］?，F(xiàn)已知伏馬霉素可誘導多種細胞凋亡，對人、動物存在潛在的致癌作用，但其引起細胞凋亡和致癌的機制目前仍然不清楚［10］。

圖3 伏馬霉素處理后TGF-β1，Smad4和PAI-1 m RNA的表達水平

細胞有增殖、分化和凋亡三方面的特性，其中，增殖是細胞生命活動的重要特征之一，在保持細胞數(shù)目的恒定、衰老與更新等方面起著重要的作用。機體創(chuàng)傷愈合、組織再生、病理組織修復等，都要依賴細胞增殖［11］。細胞的異常增殖可導致疾病的產(chǎn)生，如再生障礙性貧血、前列腺肥大、動脈粥樣硬化、高IgM血癥和惡性腫瘤等［12－14］。細胞增殖加快導致分化不全，即低分化、去分化或逆分化，進而導致腫瘤發(fā)生［15］。本研究結果顯示，F(xiàn)B1處理HepG2細胞48 h后，細胞增殖明顯增加，其機制可能與FB1抑制了神經(jīng)酰胺合酶從而促進HepG2細胞增殖有關。

TGF-β具有調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導、促進細胞外基質(zhì)的形成、調(diào)節(jié)細胞周期、促進血管生成和骨髓造血、趨化和免疫等功能［16］。近來研究表明，TGF-β在腫瘤發(fā)生早期有抑制作用［17］，但隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展，即抑癌基因失活、原癌基因突變以及染色體易位，TGF-β的抑制作用轉(zhuǎn)變?yōu)榧訌娔[瘤的運動、侵襲和轉(zhuǎn)移［18］。另有研究指出，TGF-β信號通路可通過影響脂類代謝從而促進疾病的發(fā)生發(fā)展［19］。本實驗結果表明，隨著伏馬霉素濃度的增加，HepG2細胞的增殖呈明顯上升趨勢，且TGF-β，Smad4，PAI-1 mRNA的表達顯著上調(diào)。伏馬霉素是神經(jīng)酰胺合酶的抑制劑［20］，其抑制機制可能與鞘氨基醇競爭結合神經(jīng)酰胺合酶有關［21］，研究證實神經(jīng)酰胺合酶在體外對肝癌起抑制作用［22］。本結果顯示，伏馬霉素對人肝癌HepG2株細胞增殖有明顯的促進作用，并且呈劑量依賴性，其機制可能與神經(jīng)酰胺合酶的合成受到阻礙有關［23］，具體有待進一步研究。另外，本實驗采用熒光定量PCR檢測TGF-β信號通路相關蛋白mRNA的變化，結果顯示TGF-β Smad4 PAI-1軸mRNA表達均不同程度上調(diào)，且呈劑量依賴性。這提示了伏馬霉素促進細胞增殖的機制可能與TGF-βSmad4 PAI-1信號通路的上調(diào)有關，但其促進細胞增殖的具體機制目前仍不清楚，有待進一步研究。

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Fumonisin B1 promoted HepG2 cell proliferation by up-regulating TGF-βsignaling pathway

ZENG Tian-tian，LU Xiao-dong，CHEN Lu-fang，CHEN Yuan-yuan，SHAO Qi-xiang
（School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212003，China）

Objective：To investigate the influence of Fumonisin B1（FB1）on the proliferation of HepG2 cells and its possiblemechanism.M ethods：HepG2 cellswere cultured 48 h in prepared DMEM with different concentrations of0.5，1.0，10，50μmol／L FB1，themorphology of each group were observed under inverted microscope.Cell proliferation was evaluated by Cell Counting Kit8（CCK-8）assay.The mRNA expression levels of transforming growth factor-β1（TGF-β1），Drosophila mothers against decapentaplegic 4（Smad4）and plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）were detected by quantitative real-timePCR.Results：Microscope showed that cell division was increased in parallelwith the increase of FB1 concentration.CCK-8 assay revealed that cell proliferation was remarkably increased after treatment of FB1.In the 0.5 and 1.0μmol／L groups，mRNA expression of Smad4 and PAI-1 in HepG2 cells showed no significant difference compared with control group，while in the10 and 50μmol／L groupswere increased dramatically.Conclusion：FB1 could promote cell proliferation effectively，and the elevated level of TGF-β1，Smad4 and PAI-1 in TGF-βpathway may be one ofmechanisms for promoting cell proliferation in HepG2 cells.

Fumonisin B1；cell proliferation；transforming growth factor-β1；signaling pathway；HepG2 cells

R329.28；R979.1

A

1671－7783（2014）02－0114－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140008

曾甜甜（1986—），女，碩士研究生；盧小東（通訊作者），副教授，碩士生導師，E-mail：xiaodonglu2013＠163.com

2014－01－07 ［編輯］ 劉星星