徐向輝 盛金鑫 張坤東 黃陳

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduction and activators of transcription, STAT3)是細(xì)胞內(nèi)一關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活蛋白，當(dāng)其上游Janus激酶被細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子激活后，進(jìn)而激活STAT3，形成磷酸化STAT3(p-STAT3)，2個(gè)p-STAT3分子相互作用形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、血管新生等參與腫瘤的進(jìn)展，目前已經(jīng)被定義為癌基因[1-2]。研究證實(shí)，STAT3和p-STAT3在胰腺癌組織中過(guò)表達(dá)，且p-STAT3與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)及微血管密度(microvessel density，MVD)相關(guān)[3-4]，提示STAT3的激活在胰腺癌血管生成中起重要作用。本研究采用RNA干擾技術(shù)抑制SW1990細(xì)胞STAT3基因的表達(dá)，觀察基因沉默后對(duì)細(xì)胞增殖及裸鼠移植性胰腺癌生長(zhǎng)的影響，探討其相關(guān)機(jī)制。

材料與方法

一、STAT3 shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

參考Genscript公司設(shè)計(jì)siRNA的在線軟件，選取針對(duì)STAT3編碼區(qū)1819～1837、1025～1043、237～255三段堿基序列作為RNA干擾靶序列，將其插入pRNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRNAT-STAT3 shRNA-Ⅰ、pRNAT-STAT3 shRNA-Ⅱ和pRNAT-STAT3 shRNA-Ⅲ，并同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照序列，構(gòu)建陰性對(duì)照重組質(zhì)粒pRNAT-Con。前期研究證明pRNAT-STAT3 shRNA-Ⅱ?qū)TAT3具有最好的沉默效果[5]，因此本研究選取pRNAT-STAT3 shRNA-Ⅱ穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購(gòu)自ATCC(American Type Culture Collection)，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW1990細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板中，按照Invitrogen公司說(shuō)明書配制質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物，并轉(zhuǎn)染細(xì)胞。應(yīng)用G418(500 μg/ml)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)分為SW1990組、SW1990-Con組和SW1990-RNAi組。

二、蛋白質(zhì)印跡法

取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用Santa Cruz公司的細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒和Active Motif公司的細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒分別提取各組細(xì)胞的總蛋白和核蛋白。采用常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞的STAT3、VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)蛋白的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。兔抗人STAT3、VEGF、MMP-2多抗分別購(gòu)自Cell Signal公司及Santa Cruz公司，工作濃度均為1∶1000；羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)二抗購(gòu)自Santa Cruz公司，工作濃度1∶5000。最后ECL(Santa Cruz公司)發(fā)光，X線曝光。以BAND SCAN圖像分析軟件掃描灰度值，目的條帶與β-actin條帶的灰度比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

三、裸鼠皮下移植瘤模型建立

BALB/c nu/nu裸鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中。按完全隨機(jī)法分為SW1990組、SW1990-Con組、SW1990-RNAi組，每組6只。于裸鼠右側(cè)背部皮下組織分別注射100 μl(1×108/ml)SW1990細(xì)胞、SW1990-Con細(xì)胞、SW1990-RNAi細(xì)胞。飼養(yǎng)35 d后處死裸鼠，取腫瘤稱重，用10%甲醛固定。

四、移植瘤MVD測(cè)定

取固定的移植瘤組織，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)移植瘤組織CD34的表達(dá)，以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。參照Maeda等[6]方法計(jì)算MVD，即先在低倍鏡(10×10)下尋找微血管最密集的區(qū)域，然后于高倍鏡(10×40)下取5個(gè)視野觀察，以CD34陽(yáng)性的單個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞叢作為一個(gè)可以計(jì)數(shù)的微血管，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野的微血管數(shù)，取均值。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組SW1990細(xì)胞STAT3、VEGF、MMP-2蛋白的表達(dá)

SW1990組、SW1990-Con組、SW1990-RNAi組細(xì)胞的STAT3蛋白表達(dá)量分別為84.69±9.31、82.00±7.76、7.93±1.24(圖1)，VEGF蛋白表達(dá)量分別為82.94±8.97、80.86±10.28、39.04±6.23，MMP-2蛋白表達(dá)量分別為40.88±5.09、38.26±5.71、12.54±2.15。SW1990-RNAi組細(xì)胞的表達(dá)量均顯著低于SW1990組(F分別為115.094、24.547、35.014，P值均<0.05)，而SW1990-Con組與SW1990組間細(xì)胞的3種蛋白表達(dá)量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 SW1990組(1)、SW1990-Con組(2)、SW1990-RNAi組(3)細(xì)胞STAT3蛋白的表達(dá)

二、各組裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)

注射SW1990、SW1990-Con細(xì)胞的裸鼠背部移植瘤體積較大，而注射SW1990-RNAi細(xì)胞的裸鼠移植瘤體積較小(圖2)，3組移植瘤的重量分別為(2.2±0.4)、(2.2±0.3)、(0.5±0.3)g，SW1990-RNAi組的瘤重顯著低于SW1990組和SW1990-Con組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而SW1990組與SW1990-Con組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，SW1990組和SW1990-Con組的腫瘤血供豐富、質(zhì)脆，而SW1990-RNAi組的腫瘤血管稀少，并有明顯纖維化形成。

圖2 SW1990組(1)、SW1990-Con組(2)、SW1990-RNAi組(3)裸鼠的移植瘤標(biāo)本

三、各組裸鼠移植瘤的MVD

SW1990組、SW1990-Con組、SW1990-RNAi組移植瘤的MVD分別為每高倍視野(20.35±2.41)、(18.79±1.94)、(9.62±1.06)個(gè)(圖3)，SW1990-RNAi組顯著少于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.299，P<0.01)，而其他兩組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 SW1990組(a)、SW1990-Con組(b)、SW1990-RNAi組(c)移植瘤的MVD(免疫組化 ×100)

討 論

研究表明，STAT3在多種腫瘤組織與細(xì)胞系中異常表達(dá)和激活，并與腫瘤的增殖分化、細(xì)胞凋亡、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移和免疫逃逸密切相關(guān)[1-2]。

血管生成是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過(guò)程，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管外基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移及形成管腔等一系列過(guò)程[7]。腫瘤血管生成是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)血管的支持，腫瘤直徑一般不會(huì)超過(guò)2 mm[8]。腫瘤MVD是衡量腫瘤血管生成程度的標(biāo)志，大量研究表明MVD是反映腫瘤預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立因素，高M(jìn)VD往往提示預(yù)后不良或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

血管生成過(guò)程受許多細(xì)胞因子的調(diào)控，其中VEGF是目前已知最重要的促血管生成因子，調(diào)控著包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、管腔形成等重要環(huán)節(jié)[9]。有研究報(bào)道，VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)有力和特有的有絲分裂原，與胰腺癌的血管新生和預(yù)后密切相關(guān)[10]。Niu等[11]證實(shí)VEGF是STAT3的下游靶基因，并發(fā)現(xiàn)反義寡核苷酸阻斷腫瘤細(xì)胞中STAT3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可下調(diào)VEGF的表達(dá)，抑制腫瘤新生血管形成。

在腫瘤的血管形成過(guò)程中，血管外基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移亦起著重要作用。蛋白水解酶通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，在腫瘤的血管形成中起著重要作用。MMP-2是蛋白水解酶的一種，與胰腺癌的血管形成和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。Xie等[13]證實(shí)MMP-2是STAT3下游靶基因，并發(fā)現(xiàn)STAT3可調(diào)控惡性黑色素瘤細(xì)胞中MMP-2表達(dá)，促進(jìn)惡性黑色素瘤的血管形成和侵襲轉(zhuǎn)移。

本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制SW1990細(xì)胞的STAT3基因表達(dá)，并建立穩(wěn)轉(zhuǎn)的SW1990細(xì)胞株和裸鼠移植瘤模型。結(jié)果顯示，SW1990細(xì)胞的STAT3表達(dá)被抑制后，細(xì)胞的VEGF和MMP-2表達(dá)下調(diào)，形成的裸鼠移植瘤的血管生成減少，瘤組織的MVD降低。提示STAT3信號(hào)通路在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，沉默STAT3基因表達(dá)后能明顯降低裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能通過(guò)下調(diào)VEGF及MMP-2的表達(dá)、抑制腫瘤血管生成所致。

參 考 文 獻(xiàn)

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