胡立威 陳炯 周杭城 楊仁保 陳龍江 趙躍

胰腺癌除高侵襲性及多重耐藥性外，胰周神經(jīng)浸潤也是其一個顯著特征，發(fā)生率可達54%～100%[1]。文獻證實[2]，神經(jīng)浸潤與患者臨床手術(shù)時機的選擇以及生存時間密切相關(guān)。因此，近年來越來越多的研究開始關(guān)注胰腺癌的神經(jīng)浸潤機制。文獻報道[3-4]，胰腺內(nèi)外神經(jīng)組織產(chǎn)生的許多神經(jīng)營養(yǎng)因子、黏附分子參與了胰腺癌的神經(jīng)侵襲過程。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)自分泌表達于胃、胰實體腫瘤[4]，參與胰腺腫瘤的發(fā)生、增殖，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和神經(jīng)浸潤[5-7]。本研究檢測胰腺導(dǎo)管腺癌組織中BDNF基因的表達，分析BDNF表達與胰腺癌病理參數(shù)之間的關(guān)系，探討其在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

材料與方法

一、臨床資料

收集安徽省立醫(yī)院1991年8月至2012年12月外科手術(shù)切除的46例胰腺癌及38例胰腺良性疾病患者的資料。46例胰腺癌患者中男性24例，女性22例，年齡45～76歲，病理證實均為胰腺導(dǎo)管腺癌。38例胰腺良性疾病患者中男性21例，女性17例，年齡 41～65歲，包括13例急性胰腺炎、8例慢性胰腺炎、9例胰腺囊腫、1例胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤，7例有胰管結(jié)石。另選取20例正常胰腺作為對照組，其中男性11例，女性9例，標(biāo)本來源于尸體解剖、胰腺意外傷及脾臟切除附帶的正常胰腺組織。

二、免疫組化染色

取4%甲醛固定的組織標(biāo)本，石蠟包埋，切片，常規(guī)行免疫組化染色。兔抗人BDNF單抗購自SantaClauz公司，工作濃度1∶200，生物素化標(biāo)記的鼠抗兔二抗購自北京中杉金橋公司，工作濃度1∶200，最后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，DAB反應(yīng)染色。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。腫瘤細(xì)胞或間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。由病理科醫(yī)師盲法讀片。每張切片先在低倍鏡下選取胰腺細(xì)胞密集區(qū)，再在高倍鏡下取10個視野計數(shù)1 000個細(xì)胞，計算染色細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)，以染色細(xì)胞≥20%為陽性，<20%為陰性。

三、RT-PCR法

取新鮮的組織標(biāo)本，應(yīng)用Trizol提取總RNA。BDNF上游引物為5′-TTAGCGAGTGGGTCACAGCG-3′，下游引物為5′-ATTGGGTAGTTCGGCATTGC-3′，擴增產(chǎn)物長度207 bp。以β-actin作為內(nèi)參。引物由上海生工生物工程有限公司合成。先用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(杭州博日公司)轉(zhuǎn)錄成cDNA，按說明書操作，再行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 45 s，27個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。取5μl PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，UVI凝膠成像掃描儀掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值作為mRNA的相對表達量。

四、蛋白質(zhì)印跡法

取新鮮胰腺組織切成小塊，加裂解液制備成勻漿，離心取上清進行蛋白定量。取50 μg蛋白常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測BDNF表達量。以β-actin作為內(nèi)參。所用抗體同免疫組化法抗體。最后滴加ECL發(fā)光，X線曝光、顯影、定影。應(yīng)用掃描儀掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值表示蛋白相對表達量。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、BDNF蛋白的表達

免疫組化染色顯示，正常胰腺組織僅見少許胰腺腺泡細(xì)胞的胞質(zhì)及部分導(dǎo)管細(xì)胞胞核出現(xiàn)淺黃色顆粒。胰腺導(dǎo)管腺癌組織中BDNF蛋白主要表達在癌細(xì)胞胞質(zhì)、神經(jīng)鞘膜及神經(jīng)周圍，且靠近神經(jīng)組織的癌細(xì)胞BDNF陽性程度高于遠(yuǎn)離神經(jīng)組織癌細(xì)胞(圖1)，BDNF陽性表達率為52.2%(24/46)。胰腺良性疾病BDNF陽性表達率為7.8%(3/38)，其中慢性胰腺炎2例，胰腺囊腫1例。胰腺癌與胰腺良性病變的BDNF陽性表達率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=18.706，P<0.01)。

圖1 正常胰腺組織(a)、慢性胰腺炎組織(b)、無神經(jīng)浸潤的胰腺癌組織(c)及有神經(jīng)浸潤的胰腺癌組織(d)BDNF蛋白的表達(HE ×200)

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，正常胰腺、胰腺良性疾病、胰腺癌組織中BDNF蛋白的表達量分別為0.38±0.01、0.56±0.01、0.97±0.01(圖2)。胰腺癌和胰腺良性疾病組織的BDNF表達量顯著高于正常胰腺組織(t值分別為11.407、13.032，P值均<0.01)；胰腺癌的表達量又顯著高于胰腺良性疾病(t=6.896，P<0.01)。

二、BDNF mRNA表達

正常胰腺、胰腺良性疾病、胰腺癌組織中BDNF mRNA的表達量分別為0.85±0.14、1.67±0.21、3.45±0.67。胰腺癌和胰腺良性疾病組織的表達量顯著高于正常胰腺組織(t值分別為10.304、11.425,P值均<0.01)；胰腺癌的表達量又顯著高于胰腺良性疾病(t=7.525,P<0.01)。

三、BDNF表達與胰腺癌臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性

BDNF表達與腫瘤神經(jīng)浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P值均<0.05)，而與患者年齡、性別及腫瘤直徑、部位、分化程度均無相關(guān)性(P值均>0.05，表1)。

表1 胰腺癌組織BDNF表達與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

討 論

BDNF主要分布于大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、骨和軟骨等組織內(nèi)。BDNF在腦內(nèi)主要位于大腦皮質(zhì)各層、海馬各區(qū)、腦干以及小腦的神經(jīng)元胞體及部分神經(jīng)突起。它主要定位于細(xì)胞的胞質(zhì)。通過與配體酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B，TrkB) 特異性高親和力結(jié)合，參與維持正常腦組織細(xì)胞的生理功能。也有研究證實[8]，BDNF可與TrkB或p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)結(jié)合，通過胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的瀑布效應(yīng)阻斷或介導(dǎo)細(xì)胞的程序性凋亡，從而抑制或者促進凋亡的發(fā)生[8-9]。BDNF與TrkB結(jié)合后可激活Ras癌基因，使其下游效應(yīng)因子磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)和Raf激酶啟動PI3K/Akt和Raf/MEK/ERK激酶信號途徑而抑制細(xì)胞的失巢凋亡，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移[10-11]。Pearse等[12]的研究也證實，BDNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以促進腫瘤細(xì)胞的存活，有助于腫瘤的進展。

本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織BDNF mRNA及蛋白表達量顯著高于正常胰腺組織及胰腺良性疾病組織，與文獻報道的結(jié)果相符[13-15]，提示BDNF可能參與胰腺腫瘤的自分泌生長刺激和浸潤性生長。本結(jié)果還顯示，胰腺癌組織內(nèi)的神經(jīng)鞘膜及神經(jīng)周圍亦有BDNF的表達，且靠近神經(jīng)組織的癌細(xì)胞BDNF陽性程度高于遠(yuǎn)離神經(jīng)組織癌細(xì)胞，可見BDNF的表達與腫瘤的神經(jīng)浸潤呈正相關(guān)，提示BDNF與胰腺癌神經(jīng)浸潤密切相關(guān)。臨床病理分析結(jié)果表明,BDNF的表達與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的年齡、性別及腫瘤大小、部位等因素均無顯著相關(guān)性，但與胰腺導(dǎo)管腺癌的神經(jīng)浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，也提示BDNF表達水平可能與胰腺癌患者預(yù)后有關(guān)。

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