梁春榮，劉雨輝，王葉冉，曾凡，王鑫，曹紅元，易旭，胥娟，姚秀卿，高長越，張莉莉，許志強(qiáng)，王琳，周華東，王延江

阿爾茨海默病患者外周血炎癥因子水平與認(rèn)知功能的相關(guān)性研究

梁春榮，劉雨輝，王葉冉，曾凡，王鑫，曹紅元，易旭，胥娟，姚秀卿，高長越，張莉莉，許志強(qiáng)，王琳，周華東，王延江

目的探討阿爾茨海默病(AD)患者血清中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ水平及其與認(rèn)知功能的相關(guān)性。方法納入AD患者110例，以及年齡、性別匹配的認(rèn)知功能正常的對照人群120例。搜集受試者的一般資料和疾病信息。采用簡易精神狀態(tài)量表(MMSE)和臨床癡呆評定量表(CDR)對受試者認(rèn)知功能和日常行為能力進(jìn)行評估。收集血清，采用ELISA法測定血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的濃度。比較兩組血清炎癥因子水平的差異，采用非條件logistic回歸篩選AD可能的影響因素。以全部人群為研究對象，分析血清炎癥因子水平與MMSE評分的相關(guān)性。以AD組為研究對象，分析患者血清炎癥因子水平與CDR評分的相關(guān)性。結(jié)果AD組血清中IL-1β(秩均值129.46pg/m l vs 102.70pg/m l，P=0.002)、IL-6(秩均值125.25pg/m l vs 106.56pg/m l，P=0.033)水平顯著高于對照組，但TNF-α(秩均值116.40pg/m l vs 114.67pg/m l，P=0.844)和IFN-γ(秩均值115.90pg/m l vs 115.14pg/m l，P=0.931)水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。整體人群中，僅IL-1β水平與MMSE評分呈負(fù)相關(guān)(r=－0.184，P＝0.007)。AD患者血清中各炎癥因子水平與CDR評分無相關(guān)性。危險因素分析顯示，IL-1β是罹患AD的危險因素(OR=1.018，95%CI 1.005～1.030 )，受教育年限為保護(hù)性因素(OR=0.891，95%CI 0.834～0.953)。結(jié)論血清炎癥因子水平與整體人群的認(rèn)知功能相關(guān)，但與AD患者的癡呆嚴(yán)重度無明顯相關(guān)性。

阿爾茨海默??；白細(xì)胞介素類；認(rèn)知障礙

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是以進(jìn)行性的認(rèn)知功能下降、記憶缺失、運動功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，以腦內(nèi)Aβ沉積及神經(jīng)纖維纏結(jié)為主要病理改變。研究認(rèn)為，AD的神經(jīng)退行性變與炎癥反應(yīng)相關(guān)[1]。AD患者腦內(nèi)Aβ斑塊及神經(jīng)纖維纏結(jié)周圍可以發(fā)現(xiàn)大量IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)，而在年齡匹配的正常人中并未發(fā)現(xiàn)炎癥因子[2]。腦內(nèi)長期炎癥反應(yīng)可產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用并進(jìn)一步刺激Aβ的產(chǎn)生[3]。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，炎性系統(tǒng)疾病也可促進(jìn)AD的發(fā)生發(fā)展[4]。過去對于AD患者外周血炎癥因子水平的研究較少，且結(jié)果并不一致。本研究旨在比較AD患者與正常對照人群外周血中炎癥因子水平的差異，并探討外周血炎癥因子水平與病情的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2010年1月－2013年9月第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所神經(jīng)內(nèi)科門診及住院的AD患者110例，病例資料完整。采用頻數(shù)匹配的方法從同一時期本院體檢中心選擇性別、文化程度與AD患者匹配且認(rèn)知功能正常的健康體檢人員120例。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 癡呆的診斷采用美國精神病學(xué)會的精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊(DSM-Ⅳ)標(biāo)準(zhǔn)，AD的診斷采用美國神經(jīng)病學(xué)、語言障礙和卒中-老年性癡呆和相關(guān)疾病學(xué)會(NINCDS-ADRDA)標(biāo)準(zhǔn)。健康對照組采用簡易精神狀態(tài)量表(m ini-mental state exam ination，MMSE)進(jìn)行評分，確定其認(rèn)知功能正常，判定標(biāo)準(zhǔn)：受試者所測評分大于相應(yīng)文化程度的最高值(文盲＞17分，小學(xué)＞20分，中學(xué)以上＞24分)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：可能影響認(rèn)知功能的疾病(如嚴(yán)重的帕金森病)；自身免疫疾病；近期有感染史；嚴(yán)重的心、肺、肝、腎疾病及腫瘤。

1.3 研究指標(biāo)

1.3.1 一般資料 AD患者均具備顱腦CT或MRI影像學(xué)資料。記錄患者的高血壓病、糖尿病、高低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)血癥、冠心病、自身免疫性疾病等病史信息。

1.3.2 認(rèn)知功能和日常行為能力評定 所有研究對象均有完整的MMSE和臨床癡呆評定量表(clinical dementia rating，CDR)資料，以評估其認(rèn)知功能和日常行為能力。

1.3.3 血清炎癥因子測定 采集受試者靜脈血5m l，4℃下800g離心10m in，取血清，分裝于600μl EP管中(200μl/管)，置于–80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩２捎妹嘎?lián)免疫吸附(ELISA)法測定IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ，試劑盒均購于北京四正柏生物科技有限公司，按照說明書進(jìn)行操作。采用酶標(biāo)儀(BioTek公司，美國)于450nm波長下讀取吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲取相應(yīng)炎癥因子濃度，單位均為pg/m l。

1.3.4 ApoE基因型測定 對所有血液標(biāo)本采用鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性 (PCR-RFLP)方法進(jìn)行ApoE基因型檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。血清炎癥因子水平的分布圖采用Prism軟件進(jìn)行繪制。對兩組樣本不同炎癥因子濃度進(jìn)行正態(tài)性檢驗，在數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性分布的情況下采用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗比較兩組炎癥因子水平總體分布位置是否相同；炎癥因子與MMSE和CDR的相關(guān)性采用偏相關(guān)分析法。采用非條件logistic回歸進(jìn)行AD影響因素的分析，采用向前逐步回歸法篩選變量，選入變量的檢驗水準(zhǔn)為0.05，剔除變量的檢驗水準(zhǔn)為0.10。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基線資料 AD組患者110例，其中男54例，女56例，年齡49～91(71.5±10.6)歲；對照組120例，其中男59例，女61例，年齡42～93(69.5±9.3)歲。兩組間年齡和性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。AD組CDR評分和糖尿病患病率顯著高于對照組(P＜0.05)，MMSE評分和教育水平顯著低于對照組(P＜0.05)。兩組間ApoE ε4基因擴(kuò)增水平、高血壓病和高膽固醇血癥的發(fā)生比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

2.2 兩組血清炎癥因子水平比較 對兩組炎癥因子水平的秩均值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，AD組血清中IL-1β(129.46pg/m l vs 102.70pg/m l，P=0.002)、IL-6(125.25pg/m l vs 106.56pg/m l，P=0.033)水平顯著高于對照組，但TNF-α(116.40pg/m l vs 114.67pg/m l，P=0.844)和IFN-γ(115.90pg/m l vs 115.14pg/m l，P=0.931)水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。

表1 研究對象的基線資料特征Tab.1 Baseline data of study subjects

2.3 血清炎癥因子水平與MMSE評分的相關(guān)性分析 采用偏相關(guān)分析法，校正了年齡、性別、文化程度、共患病、ApoE ε4基因型，分析全部人群血清中炎癥因子水平與MMSE評分的相關(guān)性。結(jié)果如表2所示，IL-1β水平與MMSE呈負(fù)相關(guān)(r=–0.184，P＝0.007)，而IL-6、TNF-α、IFN-γ水平與MMSE無相關(guān)性。

圖1 兩組血清炎癥因子水平的比較Fig.1 Comparison of serum inflammatory cytokine levels between AD patients and healthy controls

表2 血清炎癥因子水平與MMSE的相關(guān)性(n=230)Tab.2 Correlation between serum inflammatory cytokine levels and MMSE scores (n=230)

2.4 AD患者血清炎癥因子水平與CDR評分的相關(guān)性分析 采用偏相關(guān)分析法，校正了年齡、性別、文化程度、共患病、ApoE ε4基因型，分析AD患者血清炎癥因子水平與CDR評分的相關(guān)性。結(jié)果如表3所示，AD患者血清中炎癥因子水平與CDR無相關(guān)性，表明AD患者血清中的炎癥因子水平與AD的嚴(yán)重程度無關(guān)。

2.5 AD影響因素的多因素分析 對AD患者血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平及年齡、性別、文化程度、共患病、ApoE ε4基因型進(jìn)行非條件logistic回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-1β、IFN-γ的偏回歸系數(shù)(β)為正值且OR值大于1，說明血清中IL-1β水平越高，罹患AD的風(fēng)險越高，受教育年限偏回歸系數(shù)為負(fù)值且OR值小于1，說明受教育程度越高患AD的風(fēng)險越低(表4)。

表3 AD患者血清炎癥因子水平與CDR評分的相關(guān)性(n=110)Tab.3 Correlation between serum inflammatory cytokine levels and CDR scores in AD patients (n=110)

表4 AD影響因素的非條件logistic回歸Tab.4 Multivariate logistic analysis of risk factors for AD

3 討 論

既往已有關(guān)于AD患者血清炎癥因子水平的研究，但結(jié)論并不一致：有研究認(rèn)為在AD患者中血清IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著增高，IFN-γ水平低于對照組，在輕度認(rèn)知功能損害(MCI)患者IFN-γ、TNF-α水平顯著增高，而IL-6水平則無明顯變化[5-7]；另外有研究發(fā)現(xiàn)在AD和MCI患者血清中TNF-α水平低于對照組[8]；也有研究發(fā)現(xiàn)在AD和MCI患者腦脊液中TNF-α水平高于健康對照組[9]，而血清中TNF-α水平無明顯差異。不過，既往這些有關(guān)AD患者血清炎癥因子水平的研究樣本量均較小，入組人數(shù)從十余人到數(shù)十人不等。

為了更好地反映AD患者血清炎癥因子水平的變化，本研究選擇了110例患者進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，AD患者血清IL-6和IL-1β水平均增高。這一發(fā)現(xiàn)與AD腦內(nèi)神經(jīng)炎癥的病理變化一致。既往對AD患者尸檢并采用免疫組化染色發(fā)現(xiàn)大腦皮質(zhì)斑塊周圍有大量的IL-6、IL-1β表達(dá)[10]。

關(guān)于血清中炎癥因子的來源目前尚不清楚，可能來自于外周組織、血液白細(xì)胞及血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞，也可能來源于大腦炎癥反應(yīng)。研究表明，腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)可促進(jìn)外周血細(xì)胞炎癥因子的釋放，而外周血中的炎癥因子也可改變血-腦脊液屏障的通透性，促進(jìn)炎癥因子及白細(xì)胞進(jìn)入腦內(nèi)[11-12]。在AD患者腦內(nèi)，Aβ可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用，并誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β等炎癥因子釋放[13-14]，炎癥因子又可誘導(dǎo)神經(jīng)元β-淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)合成增加[15]和Aβ產(chǎn)生[16]，Aβ與炎癥因子在腦內(nèi)形成惡性循環(huán)，相互促進(jìn)，促使Aβ生成增多和神經(jīng)元變性死亡。

目前眾多觀點支持炎癥反應(yīng)參與了AD的發(fā)生，認(rèn)為在AD癥狀出現(xiàn)之前腦內(nèi)已存在炎癥反應(yīng)，腦內(nèi)的炎癥因子會通過血-腦脊液屏障進(jìn)入血液，并可在后續(xù)促使外周血細(xì)胞釋放炎癥因子[17-18]。因此，有學(xué)者提出檢測外周血中的炎癥因子水平并將其作為診斷AD的生物標(biāo)志物[19]。但是，目前尚缺乏血液炎癥因子與認(rèn)知功能和癡呆嚴(yán)重程度相關(guān)性的研究。本研究結(jié)果表明，血清IL-1β水平與整體人群的MMSE呈負(fù)相關(guān)，但I(xiàn)L-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎癥因子水平卻與AD患者的癡呆嚴(yán)重程度無相關(guān)性，且這些炎癥因子也不是AD的特異性分子，該結(jié)果提示炎癥反應(yīng)參與了AD的發(fā)生，但將炎癥因子作為AD診斷的生物標(biāo)志物并不合適。

后續(xù)我們將進(jìn)一步在MCI階段即AD發(fā)生前期的人群中探尋特異性、高表達(dá)的炎癥因子并通過較大樣本、前瞻、對照設(shè)計的臨床研究探討炎癥因子在AD發(fā)生、發(fā)展中的作用。

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Correlation between serum inflammatory factor levels and cognitive function in patients withAlzheimer's disease

LIANG Chun-rong, LIU Yu-hui, WANG Ye-ran, ZENG Fan, WANG Xin, CAO Hong-yuan, YI Xu, XU Juan, YAO Xiuqing, GAO Chang-yue, ZHANG Li-li, XU Zhi-qiang, WANG Lin, ZHOU Hua-dong, WANG Yan-jiang*
Department of Neurology, Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China
*

, E-mail: yanjiang_wang@tmmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the serum levels of inflammatory cytokines IL-6, IL-1β, TNF-α and IFN-γ, and explore the correlation between the inflammatory factor levels and the cognitive function in patients w ith Alzheimer's disease (AD).MethodsOne hundred and ten AD patients and 120 cognitively normal subjects were recruited in the present study.Serum levels of IL-6, IL-1β, TNF-α and IFN-γ were determ ined with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).M ini-Mental State Examination (MMSE) and Clinical Dementia Rating Scale (CDR) were used to assess the cognitive function and activities of day living of the subjects.Wilcoxon rank sum test was used to compare the inflammatory cytokine levels between AD patients and healthy controls.Non-conditional logistic regression model was used to screen the potential influence factors of AD.Partial correlation analysis was performed to study the correlation between inflammatory cytokine levels of all subjects and MMSE scores in the whole sample, and the correlation between the serum levels of inflammatory cytokines and CDR scores was exam ined in the ADcohort.ResultsThe serum levels of IL-1β (129.46 vs 102.70, P=0.002) and IL-6 (125.25 vs 106.56, P=0.033) were significantly higher in AD patients than that of normal control, while the values of TNF-α (116.40 vs 114.67, P=0.844) and IFN-γ (115.90 vs 115.14, P=0.931) were not significantly different between the two groups.The serum levels of IL-1β was correlated with MMSE score (r=–0.184, P=0.007) in the whole sample.No significant correlation was observed between serum inflammatory factors and CDR scores in AD patients.IL-1β was identified as a risk factor (OR=1.018, 95%CI 1.005-1.030), and duration of receiving education as a protective factor (OR=0.891, 95%CI 0.834-0.953) for AD.ConclusionThe serum levels of inflammatory factors may be correlated with the cognitive function but not with the severity of dementia in AD patients.

Alzheimer disease; interleukins; cognition disorders

749.16

0577-7402(2014)02-0133-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2014.02.11

2013-12-17；

2014-01-13)

(責(zé)任編輯：沈?qū)?

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (30973144, 81270423), Science Fund of Chongqing Municipality for Distinguished Young Scholars (CSTC 2010BA5004), China Postdoctoral Science Foundation (2013T60955), and Scientific Projects of Chongqing Municipality for Postdoctoral Research (Xm201342)

國家自然科學(xué)基金(30973144、81270423)；重慶市杰出青年科學(xué)基金(CSTC 2010BA5004)；中國博士后科學(xué)基金(2013T60955)；重慶市博士后科研項目(Xm201342)

梁春榮，碩士研究生。主要從事老年癡呆發(fā)病機(jī)制方面的研究

400042 重慶 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所神經(jīng)內(nèi)科(梁春榮、劉雨輝、王葉冉、曾凡、王鑫、曹紅元、易旭、胥娟、姚秀卿、高長越、張莉莉、許志強(qiáng)、王琳、周華東、王延江)

王延江，E-mail: yanjiang_wang@tmmu.edu.cn