談紅，陳瑞敏，李曉燕，張紅明，楊永耀，陳英劍

瑞舒伐他汀對急性冠脈綜合征患者CD4+T淋巴細(xì)胞m iRNA表達(dá)的影響

談紅，陳瑞敏，李曉燕，張紅明，楊永耀，陳英劍

目的研究瑞舒伐他汀對急性冠脈綜合征(ACS)患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞基因中微小RNA(miRNA)表達(dá)譜的影響，探討瑞舒伐他汀鈣治療ACS的機(jī)制。方法選取2012年3－7月入住濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院的9例ACS患者，另以因疑似不典型冠心病癥狀而行320CT示冠脈病變≤50%的住院患者9例作為正常對照組。利用密度梯度法離心分離ACS患者及對照者的外周血單核細(xì)胞，免疫磁珠法進(jìn)一步分離出CD4+T淋巴細(xì)胞。采用miRNA基因芯片技術(shù)檢測CD4+T淋巴細(xì)胞m iRNA的表達(dá)譜，篩選ACS患者與正常對照組，以及ACS患者用藥前后差異表達(dá)的m iRNA。選取其中差異性最為顯著的3個miRNA，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對差異表達(dá)的m iRNA進(jìn)行驗證。結(jié)果通過基因芯片共檢測基因1900余條，其中有差異的有300余條。與正常對照比較，ACS患者中顯著上調(diào)的基因有126條，如miRNA-21、m iRNA-142、m iRNA-20a等，顯著下調(diào)的基因有202條，如m iRNA-4734、m iRNA-1182、m iRNA1273f等。ACS患者服用瑞舒伐他汀鈣(20mg，1次/d)10d后，與用藥前相比，顯著上調(diào)的基因有157條，如miRNA-4734、miRNA-1182、miRNA-663b等，顯著下調(diào)的基因有137條，如m iRNA-4789、m iRNA-5692c、m iRNA-26a等。采用RT-PCR進(jìn)一步驗證，結(jié)果與m iRNA芯片檢測結(jié)果一致。結(jié)論瑞舒伐他汀鈣可能通過調(diào)節(jié)m iRNA-4734、m iRNA-1182、m iRNA-4789等m iRNA的表達(dá)從而發(fā)揮其對ACS的治療作用。

微RNAs；急性冠脈綜合征；瑞舒伐他??；寡核苷酸序列分析

微小核糖核酸(m icroRNAs，m iRNAs)是一類在人類和動物中廣泛存在的高度保守的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，是由具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的70～90個堿基的RNA前體經(jīng)Dice酶加工后生成的18～24個堿基的單鏈小分子RNA[1]。自2006年van Rooij等[2]發(fā)現(xiàn)miRNA在心血管疾病中發(fā)揮著重要作用以來，m iRNA日益成為心血管領(lǐng)域的研究熱點。近年來研究發(fā)現(xiàn)，m iRNA參與了動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)生發(fā)展過程中炎性細(xì)胞的調(diào)控[3-4]。急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)是AS斑塊破裂、出血，產(chǎn)生纖維蛋白并激活凝血系統(tǒng)的過程。有研究表明炎癥貫穿于這一過程的始末[5-6]。AS是ACS的病理基礎(chǔ)，與脂質(zhì)代謝障礙密切相關(guān)。CD4+CD 25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一種新型的輔助性T細(xì)胞，Th17/Treg亞群失衡與ACS的發(fā)生密切相關(guān)[7]。斑塊中T淋巴細(xì)胞的大量活化可降低斑塊的穩(wěn)定性，使其易于破裂。

瑞舒伐他汀可明顯抑制ACS的炎癥反應(yīng)，抑制外周血單核來源的樹突細(xì)胞(DCs)成熟，并影響T淋巴細(xì)胞的增殖及遷移能力，且可明顯改善冠心病患者Th1/Th2細(xì)胞亞群的平衡[8]。有研究表明，miRNA參與了CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的分化和活化過程[9-10]。本實驗檢測了瑞舒伐他汀對于ACS患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中m iRNA表達(dá)譜的影響，旨在探討瑞舒伐他汀鈣對ACS發(fā)揮治療作用的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2012年3－7月入住濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科的ACS患者9例(ACS組)，其中不穩(wěn)定型心絞痛(UA)、非ST段抬高心肌梗死(NSTEM I)、ST段抬高心肌梗死(STEM I)各3例，男6例，女3例，年齡60.9±10.4歲，體重指數(shù)25.4±18.9kg/m2。入選標(biāo)準(zhǔn)：典型的缺血性胸痛等臨床表現(xiàn)；典型的缺血性心電圖改變(新發(fā)的完全性左束支傳導(dǎo)阻滯，病理性Q波或一過性ST段、T波改變)；如果心臟標(biāo)記物cTnT/cTn I或CK-MB水平升高，可診斷為AM I，如果標(biāo)記物沒有超過正常范圍診斷為UA。因疑似不典型冠心病癥狀而行320排CT示冠脈病變≤50%的9例住院患者作為正常對照組，其中男5例，女4例，年齡60.3±8.6歲，體重指數(shù)24.9±20.8kg/m2。排除標(biāo)準(zhǔn)：感染、全身免疫性疾病、嚴(yán)重的肝腎功能不全、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病及自身免疫性疾病，既往有結(jié)核、肝炎、腫瘤等慢性病史。兩組患者年齡、性別、體重指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。入選前兩組均簽署知情同意書。ACS患者給予瑞舒伐他汀鈣(可定，阿斯利康制藥公司)20mg，1次/d，共10d，分別采集用藥前后外周群脈血留樣檢查。

1.2 主要試劑及設(shè)備 改良的RPM I 1640培養(yǎng)基(美國Hyclone)，人淋巴細(xì)胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)，胎牛血清(上海玉博生物科技有限公司)，Deso、臺酚藍(lán)(青島海泰生物技術(shù)有限公司)，細(xì)胞計數(shù)板(南京裕安儀器有限公司)，人CD4+免疫磁珠、MS分離柱、磁力架(德國美天旎公司)，Trizol(美國Invitrogen)，核酸蛋白測定儀(美國Bio-Rad)，m iRNeasy試劑盒(北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司)，熒光顯微鏡(日本O lympus公司)，雜交爐(美國Agilent)；Gene Pix 4000B微陣列掃描儀(美谷分子儀器有限公司)；分光光度計(ND 1000，美國Nanodrop)；m iRCURYTM陣列功率標(biāo)記試劑盒，ABI Sybr Green PCR Master M ix(北京萌壯科技有限公司)，ABI Stepone Plus型熒光定量PCR儀(上海創(chuàng)萌生物科技有限公司)。

1.3 CD4+T淋巴細(xì)胞的分離與鑒定 在征得患者知情同意后，于住院次日晨采集新鮮外周靜脈血12m l于肝素抗凝試管中。采用密度梯度離心法分離人外周血單個核細(xì)胞，以CD 4+免疫磁珠分選試劑盒進(jìn)一步從單個核細(xì)胞中分離出CD4+T淋巴細(xì)胞。臺盼藍(lán)鑒定CD4+T淋巴細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)，然后加入凍存液于－80℃中凍存待用。ACS患者入院后給予瑞舒伐他汀鈣20mg口服，1次/d，10d。10d后再次抽取患者外周血12m l，提取CD4+T淋巴細(xì)胞，同樣于－80℃中凍存待用于基因篩選。

1.4 差異性表達(dá)m iRNAs的篩選 取收集的CD4+T淋巴細(xì)胞，采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，取40μg總RNA，用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)法分離純化m iRNA。用分光光度計測定RNA的濃度，甲醛變性凝膠電泳質(zhì)檢RNA的質(zhì)量。采用m iRCURYTMArray Power標(biāo)記試劑盒，用Hy3TM標(biāo)記miRNA得到熒光探針，在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用Phalanx的熱收縮雜交袋將標(biāo)記好的探針和m iRNA芯片雜交。使用GenePix4000B微陣列掃描儀掃描芯片的熒光強度，GenePix Pro 6.0圖像分析軟件對圖像進(jìn)行分析，把圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，然后用SAM軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，篩選出ACS患者與正常對照者CD4+T淋巴細(xì)胞差異表達(dá)的m iRNA。判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)：歸一化強度的比值(fold chang)≥1.5時表示基因表達(dá)上調(diào)，≤0.67時表示基因表達(dá)下調(diào)。

1.5 瑞舒伐他汀鈣干預(yù)后CD 4+T淋巴細(xì)胞差異表達(dá)m iRNA的RT-PCR驗證結(jié)果 根據(jù)基因芯片篩選結(jié)果，選取其中表達(dá)差異最為顯著的3個m iRNA(m iR4734、m iR1182、m iR4789)進(jìn)行驗證。選取2012年3－7月入住我科ACS患者48例(包括UA、NSTEM I、STEM I各16例)，其中男28例，女20例，年齡74.0±7.91歲，分別抽取入院第2天及服用瑞舒伐他汀鈣(20mg/d，共10d)后的空腹血，用免疫磁珠法分離CD 4+T淋巴細(xì)胞，分離后加入凍存液－80℃凍存，待病例收集完后一起行RT-PCR驗證。采用Trizol一步法提取細(xì)胞RNA，用分光光度計測定RNA濃度，甲醛變性凝膠電泳質(zhì)檢RNA的質(zhì)量。使用ABI SybrGreen PCR Master M ix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，ABI Stepone Plus型熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。m iRNA驗證引物及內(nèi)參照U 6引物由上海生工股份有限公司提供。U 6：正義5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反義5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；m iR-4734：正義5'-ACACTCCAGCTGGGGCTGCGGGCTGCG GTC-3'，反義5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；m iR-1182：正義5'-ACACTCCAGCTGGGGAGGGTCTTG GGAGGG-3'，反義5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；miR-4789：正義5'-ACACTCCAGCTGGGCACACATA GCAGGTGT-3'，反義5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'。擴(kuò)增條件：95℃ 2m in；95℃ 10s，60℃ 40s，72℃30s，40個循環(huán)。然后進(jìn)行熔解曲線分析。引物大小通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗證。為確保所有試驗數(shù)據(jù)的有效性，每次試驗都常規(guī)設(shè)置陰性對照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CD4+T淋巴細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)及總RNA質(zhì)量鑒定情況 經(jīng)0.2%臺盼藍(lán)鑒定CD4+T淋巴細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)為94.6%±2.4%。RNA質(zhì)量檢測顯示符合m iRNA芯片實驗要求。

2.2 基因芯片篩選結(jié)果 本實驗通過m iRNA基因芯片檢測1900余條基因信號，篩選結(jié)果顯示，相對于正常對照者，ACS患者外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞中差異性表達(dá)的基因有328條，其中顯著上調(diào)的基因有126條，如m iRNA-21-5p、m iRNA-142-3p、miRNA-20a-5p等(表1)，顯著下調(diào)的基因有202條，如miRNA-4734、miRNA-1182、miRNA-1273f等(表2)。

2.3 瑞舒伐他汀鈣干預(yù)后差異性表達(dá)的m iRNA瑞舒伐他汀鈣藥物干預(yù)10d后，與用藥前比較差異性表達(dá)的基因共有294條，其中顯著上調(diào)的基因157條，如m iRNA-4734、m iRNA-1182、m iRNA-663b等(表3)，顯著下調(diào)基因有137條，如m iRNA-4789-3p、m iRNA-5692c、miRNA-26a-5p等(表4)。

2.4 差異表達(dá)m iRNA的RT-PCR驗證結(jié)果 RTPCR結(jié)果顯示，與用藥前相比，ACS患者使用瑞舒伐他汀鈣(20mg/d，10d)后，hsa-m iR-4734、hsam iR-1182表達(dá)均顯著上調(diào)，hsa-m iR-4789表達(dá)顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與基因表達(dá)譜芯片檢測結(jié)果一致(圖1)。

表1 與對照組比較ACS患者顯著上調(diào)的前5位基因Tab.1 Top 5 genes show ing significant up-regulation in ACS patients compared w ith normal controls

表2 與對照組比較ACS患者顯著下調(diào)的前5位基因Tab.2 Top 5 genes showing significant down-regulation in ACS patients compared with normal controls

表3 瑞舒伐他汀鈣藥物干預(yù)后表達(dá)顯著上調(diào)的前5位基因Tab.3 Top 5 genes showing significant up-regulation after rosuvastatin treatment

表4 瑞舒伐他汀鈣藥物干預(yù)后表達(dá)顯著下調(diào)的前5位基因Tab.4 Top 5 genes show ing significant down-regulation after rosuvastatin treatment

圖1 瑞舒伐他汀鈣用藥前后差異表達(dá)m iRNA的實時定量PCR驗證Fig.1 Differential expression of m iRNA detected by real-time quantitative PCR(1)P＜0.05 compared with before treatment

3 討 論

瑞舒伐他汀是一種新型3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，2002年在荷蘭上市，被認(rèn)為是目前作用最強的他汀類降脂藥。對于ACS患者，歐洲血脂指南強調(diào)應(yīng)進(jìn)行強化降脂，即無論低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平如何，都應(yīng)該將血脂降低到700mg/L以下，或在原來基礎(chǔ)上降低50%。因為只有高強度他汀降脂才能阻斷粥樣斑塊進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)，長期大劑量服用瑞舒伐他汀在穩(wěn)定粥樣斑塊的同時，還可以起到逆轉(zhuǎn)斑塊的作用[11-12]。對瑞舒伐他汀類藥物的研究發(fā)現(xiàn)，對于ACS患者，短期大劑量給藥并不能明顯降低LDL-C，但可以顯著降低IL-6、高敏C-反應(yīng)蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)等炎性因子，減少體內(nèi)凝集素誘導(dǎo)的白細(xì)胞翻轉(zhuǎn)、黏附及遷移，而血管內(nèi)皮細(xì)胞合成、分泌一氧化氮明顯增加[13-14]。血管性血友病因子(VWF)是反映急性內(nèi)皮損傷的特異性炎性因子，其血漿水平是ACS的獨立預(yù)后因素。研究表明，短期應(yīng)用大劑量瑞舒伐他汀可使血漿VWF水平明顯降低[15]。Link等[16]研究發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀治療能夠顯著降低促炎細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ的血漿濃度，同時可使活化T淋巴細(xì)胞中TNF-α和IFN-γ的生成顯著降低，從而起到穩(wěn)定斑塊的作用。近年來，瑞舒伐他汀獨立于調(diào)脂作用外的抗炎作用越來越受到重視[17]。

m iRNA在心血管方面起著重要的作用，從最初的心臟發(fā)育到最終的心肌細(xì)胞凋亡壞死都有相對特異的m iRNA的參與[18]。m iRNA在外周循環(huán)血中穩(wěn)定表達(dá)，使其可能作為冠心病潛在的生物學(xué)標(biāo)志物[19]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-125a-5p可調(diào)節(jié)單核/巨噬細(xì)胞攝取脂質(zhì)并且減少IL-2、IL-6、TNF-α和TGF-β等炎性因子的分泌[3]。M inam i等[20]報道阿托伐他汀治療可通過降低m iRNA-221/m iRNA-222水平從而增加冠心病患者內(nèi)皮袓細(xì)胞(EPCs)的數(shù)量，而普伐他汀效果甚微，提示m iRNA可能是部分他汀類降脂藥的作用靶點。本實驗通過比較ACS患者與正常對照組，以及ACS患者用藥前后外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中m iRNA的變化情況，了解其變化規(guī)律，進(jìn)一步闡明瑞舒伐他汀在ACS中的作用機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)一種或幾種高度差異表達(dá)的m iRNA，以方便應(yīng)用于以后的臨床研究。經(jīng)基因芯片技術(shù)篩選后我們得出的許多m iRNA同文獻(xiàn)報道一致[20-23]，但仍有個別m iRNA存在差異，可能與病例收集人群(本文病例選取范圍更廣泛，包含UA、NSTEM I、STEM I患者，而相關(guān)文獻(xiàn)中只針對UA患者)、采樣時間、樣本處理、樣本量大小等有一定關(guān)系。目前鮮有調(diào)脂藥對ACS患者m iRNA表達(dá)影響的研究，本文通過m iRNA基因芯片技術(shù)檢測短期給予大劑量瑞舒伐他汀鈣后ACS患者CD 4+T淋巴細(xì)胞中m iRNA的差異表達(dá)情況，結(jié)果顯示m iRNA-4734、m iRNA-1182、m iRNA-663b、m iRNA-4419b、m iRNA-4417等表達(dá)顯著上調(diào)，m iRNA-4789-3p、m iRNA-5692c、m iRNA-26a-5p、m iRNA-142-3p、m iRNA-4659b-5p等表達(dá)顯著下調(diào)，而通過該基因芯片檢測ACS患者與正常對照組的miRNA表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，ACS患者m iRNA-4734、m iRNA-1182的表達(dá)與正常對照比較顯著下調(diào)，但藥物干預(yù)后卻急劇升高。雖然m iRNA-4789-3p的表達(dá)水平在ACS患者與正常對照中無明顯差異，但在ACS患者中用藥后顯著下降，變化幅度較大。因此我們推測，m iRNA-4734、m iRNA-1182、m iRNA-4789-3p在ACS中可能具有重要作用，大劑量短期應(yīng)用瑞舒伐他汀可能通過調(diào)節(jié)m iRNA-4734、m iRNA-1182、m iRNA-4789-3p等m iRNA的表達(dá)來改善ACS患者的預(yù)后。

綜上所述，短期大劑量應(yīng)用瑞舒伐他汀鈣可能通過調(diào)節(jié)ACS患者m iRNAs的表達(dá)而引起外周血CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的變化，進(jìn)而起到改善患者預(yù)后的作用，該結(jié)果從分子機(jī)制上進(jìn)一步闡述了瑞舒伐他汀鈣在ACS治療中的作用，但其具體的信號通路及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。

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Differences of CD4+ T lymphocyte miRNA gene expression in acute coronary artery syndrome(ACS) patients and the effects of rosuvastatin on its expressions

TAN Hong1, CHEN Rui-min1, LI Xiao-yan1*, ZHANG Hong-m ing1, YANG Yong-yao2, CHEN Ying-jian31Department of Cardiology,3Department of Clinical Laboratory, General Hospital of Jinan Command, Jinan 250031, China
2Department of Cardiology, People’s Hospital of Guizhou Province, Guiyang 550002, China
*

, E-mail: lixiaoyan902006@126.com

ObjectiveTo investigate the effects of rosuvastatin on the expression profile of peripheral blood CD4+T lymphocytes m iRNA gene in the patients w ith acute coronary syndrome (ACS) and screen the differentially expressed m iRNAs before and after treatment, and elucidate the mechanisms of rosuvastatin calcium in the treatment of patients with ACS.MethodsNine cases were selected from the patients w ith ACS treated in the General Hospital of Jinan M ilitary Command from Mar.to Jul.of 2012, w ith other 9 cases selected as controls, whose degree of coronary artery stenosis was less than 50% as confirmed by 320CT.Peripheral blood mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation, and CD4+T lymphocytes were isolated by immunomagnetic beads method.m iRNAs of CD4+T lymphocytes were detected by m iRNA gene chip technology.The differentially expressed m iRNAs between ACS patients and normal control, and those in ACS patients before and after treatment were screened.Three of the maximum difference miRNAs were selected and followed by verification by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsMore than 1900 genes were detected by gene m icroarray, of which more than 300 genes showed significant differences in expression.Comparing the ACS patients and normal controls, 126 genes were significantly up-regulated, including miRNA-21, miRNA-142, and m iRNA-20a; and 202 genes were significantly down-regulated, including miRNA-4734, miRNA-1182, and m iRNA-1273f.A total of 157 genes were significantly up-regulated after treatment w ith rosuvastatin calcium (20mg/d×10d),such as m iRNA-4734, miRNA-1182, and m iRNA-663b; and 137 genes were significantly down-regulated, such as miRNA-4789, m iRNA-5692c, and m iRNA-26a.The results were validated by RT-PCR and they were same as m iRNA m icroarray.ConclusionRosuvastain may play a role in the treatment of patients with ACS by regulating a series of m iRNAs such as miRNA-4734, miRNA-1182, and miRNA-4789.

m icroRNAs; acute coronary syndrome; rosuvastatin; oligonucleotide array sequence analysis

R541.4

0577-7402(2014)02-0099-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2014.02.04

2013-08-07；

2013-12-02)

(責(zé)任編輯：張小利)

This work was supported by the Scientific and Technological Project of Guizhou Province [SY20103081]

貴州省科技攻關(guān)項目[SY(20103081)]

談紅，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師。主要從事冠狀動脈粥樣硬化相關(guān)的基礎(chǔ)及臨床研究

250031 濟(jì)南 濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科(談紅、陳瑞敏、李曉燕、張紅明)，檢驗科(陳英劍)；550002 貴陽 貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科(楊永耀)

李曉燕，E-mail：lixiaoyan902006@126.com