杜正彩 鄧家剛 黃慶 龐國鳳 李好文

復(fù)方桑椹三七對(duì)鏈脲霉素糖尿病小鼠血糖與胰島病理的影響

杜正彩 鄧家剛 黃慶 龐國鳳 李好文

目的 研究復(fù)方桑椹三七（CMN）對(duì)鏈脲霉素致糖尿病小鼠血糖與胰島病理的影響。方法 取雄性昆明（KM）小鼠，用鏈脲霉素(STZ)（150 mg/kg）腹腔注射造模，選取血糖值在11～25 mmol/L小鼠50只，隨機(jī)分為模型組，陽性組（格列苯脲5 mg/kg），CMN高、中、低（9．0，3．0，1．5 g/kg）劑量組（n=10），另取10只未造模小鼠為正常對(duì)照組。灌胃給藥30 d，測(cè)定小鼠飲食、體質(zhì)量、血糖、血清胰島素水平，并將小鼠胰島β細(xì)胞免疫染色，觀察其病理變化。結(jié)果 CMN對(duì)糖尿病小鼠攝食量、排尿量、飲水量、空腹血糖與胰島素水平的影響與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01或P＜0．05）；病理切片顯示CMN可使小鼠胰島β細(xì)胞免疫染色陽性數(shù)量明顯增加，病理損傷明顯好轉(zhuǎn)，具體數(shù)據(jù)為，攝食量：正常組為（5．13±0．67）、模型組為（8．91±0．81）、格列苯脲組為（6．6±0．83）、CMN高劑量組為（4．56±0．89）、CMN中劑量組為（6．63±0．49）、CMN低劑量組為（8．26±0．92）；飲水量：正常組為（6．21±0．59）、模型組為（21．95±5．58）、格列苯脲組為（13．13±1．73）、CMN高劑量組為（10．19±2．00）、CMN中劑量組為（13．45±2．82）、CMN低劑量組為（16．80±5．68）；排尿量：正常組為（4．17±0．49）、模型組為（20．31±4．97）、格列苯脲組為（11．38±1．98）、CMN高劑量組為（9．63±2．13）、CMN中劑量組為（12．49±2．79）、CMN低劑量組為（15．53±5．66）；空腹血糖（第30天）：正常組為（4．91±0．89）、模型組為（20．58±6．69）、格列苯脲組為（12．71±6．60）、CMN高劑量組為（11．73±3．55）、CMN中劑量組為（12．52±6．78）、CMN低劑量組為（14．28±5．57）；血清胰島素水平：正常組為（10．12±1．27）、模型組為（4．68±1．29）、格列苯脲組為（6．80±1．54）、CMN為高劑量組（6．23±1．62）、CMN中劑量組為（5．93±1．12）、CMN低劑量組為（5．72±0．97）；胰島病理評(píng)分：正常組為（2．90±0．54）、模型組為（1．00±0．82）、格列苯脲組為（2．00±0．77）、CMN高劑量組為（2．40±0．49）、CMN中劑量組為（2．10±0．83）、CMN低劑量組為（1．90±0．54）。結(jié)論 CMN對(duì)糖尿病小鼠攝食量、飲水量、排尿量及空腹血糖具有明顯降低作用，這可能與其保護(hù)修復(fù)胰島β細(xì)胞，恢復(fù)胰島素的分泌水平相關(guān)。

桑椹；三七；小鼠；鏈脲霉素；糖尿病

桑椹為?？粕orus alba L.的果穗，唐·蘇敬《新修本草》記載“單食，止消渴”，中國藥典記載主治“津傷口渴，內(nèi)熱消渴”，現(xiàn)代研究其具有降血糖的作用[1-3]。三七為五加科植物三七Panaxnotoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根，具有活血、止血、定痛的作用，現(xiàn)代研究表明它具有降血糖，降血脂，改善糖尿病微血管病變等作用[4-6]。復(fù)方桑椹三七（Compound Mulberry fruit notoginseng，CMN）是廣西中醫(yī)藥大學(xué)鄧家剛教授治療糖尿病臨床驗(yàn)方，在臨床實(shí)踐中將桑椹三七配伍應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)其具有明顯解除糖尿病患者口渴多飲的作用，并能減少糖尿病患者微血管病變等并發(fā)癥。本研究采用鏈脲霉素(STZ)致糖尿病小鼠來研究復(fù)方桑椹三七的降血糖作用及其作用機(jī)制，為今后產(chǎn)品開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 桑椹（熟），產(chǎn)地廣西，南寧生源中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)：20101001；三七（30頭），產(chǎn)地廣西，南寧生源中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)：20100902（藥材經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為正品）。

取桑椹500 g、三七500 g混合，加10倍量水，浸泡1 h后，煎煮1 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，合并藥液，濃縮至1000 mL，冷卻至室溫，然后緩慢加入2000 mL的95%乙醇，邊加邊用玻璃棒緩慢攪拌，沉淀過夜，過濾，濾液濃縮至500 mL（2 g/mL）每毫升相當(dāng)2.0 g原生藥（備用）。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性昆明（KM）小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，質(zhì)量合格證號(hào)No.20101805，許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室溫度：22～25℃，相對(duì)濕度：55%～70%。

1.3 試劑 STZ，25 g/瓶，美國Sigma-Aldrich，Lot# BCBB 7829；格列本脲片，2.5 mg/片，天津太平洋制藥有限公司，批號(hào)：101003；血糖測(cè)試條，長沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司，批號(hào)：20100505；小鼠胰島素（INS）定量檢測(cè)ELISA試劑盒，美國R&D公司，批號(hào)：20101103；Mouse Anti-Insulin、DBA顯色試劑盒、SABC免疫組化染色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)；20101103。

1.4 儀器 Thermo scientifi 1500-multiskan spectrum酶標(biāo)儀，美國；Thermo-22190石蠟病理切片機(jī)，美國。低溫超速離心機(jī)（TGL-16 M），湖南塞特湘儀有限公司；EL 204十萬分之一克電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；安穩(wěn)血糖快速測(cè)試儀，長沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司。

1.5 方法[7]取雄性KM小鼠80只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后體質(zhì)量（25±2）g，按體質(zhì)量隨機(jī)分出10只為正常對(duì)照組，其余70只用于造模。所有小鼠禁食（每次禁食的同時(shí)必須換墊料，下同）不禁水12 h，除正常對(duì)照組注射等體積生理鹽水外，其余各鼠腹腔注射鏈脲霉素，小鼠劑量150 mg/kg（臨用前溶解于0.1 mol/ L、pH 4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，置于冰上）。造模5 d后，禁食不禁水3 h，尾靜脈取血，用快速血糖儀測(cè)試血糖。除正常組外，其余小鼠取血糖值在11～25 mmol/L的糖尿病小鼠50只，按血糖高低重新隨機(jī)分為模型組，陽性組（格列苯脲5 mg/kg），CMN高、中、低（9.0，3.0，1.5g/kg）劑量組，每組10只，灌胃給藥，1次/d，正常組、模型組給蒸餾水，療程為30 d，于給藥第0與第30 d測(cè)空腹血糖值（禁食同前），比較各組動(dòng)物血糖值及血糖下降百分率，血糖下降百分率=（實(shí)驗(yàn)前血糖值-實(shí)驗(yàn)后血糖值）/實(shí)驗(yàn)前血糖值×100%。每天測(cè)定小鼠飲水量、攝食量與體質(zhì)量；換墊料1次/d，排尿量=（末時(shí)墊料濕重-初始?jí)|料干重）×80%。末次給藥后，禁食不禁水3 h，尾靜脈取血，用快速血糖儀測(cè)試血糖，摘眼球取血測(cè)定血清胰島素水平（按試劑盒說明進(jìn)行）。

胰島β細(xì)胞免疫染色：眼球取血后，隨即頸椎脫臼處死小鼠，同時(shí)迅速在解剖鏡下解剖胰腺組織，用福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm石蠟切片，染色，按S-P試劑盒說明進(jìn)行操作，DBA染色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。β細(xì)胞陽性表達(dá)根據(jù)呈顯不同程度的棕黃色團(tuán)塊數(shù)及其面積大小，可分為5個(gè)等級(jí)評(píng)分：在1張切片內(nèi)，若棕黃色團(tuán)塊數(shù)（β細(xì)胞陽性表達(dá)）≤3個(gè)，且團(tuán)塊面積均很小時(shí)，計(jì)為0分；若棕黃色團(tuán)塊數(shù)在4～6個(gè)，且面積較大時(shí)，計(jì)為1分；若棕黃色團(tuán)塊數(shù)在7～9個(gè)，且面積較大時(shí)，計(jì)為2分；若棕黃色團(tuán)塊數(shù)在10～12個(gè)，且面積較大時(shí)，計(jì)為3分；若棕黃色團(tuán)塊數(shù)≥13個(gè)，且面積較大時(shí)，計(jì)為4分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)。正態(tài)計(jì)量資料以“x±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 CMN對(duì)糖尿病小鼠飲水量、排尿量與攝食量的影響如表1所示，與模型組比較，CMN高、中、低劑量組小鼠的攝食量、飲水量、排尿量明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 CMN對(duì)糖尿病小鼠攝食量、飲水量與排尿量影響試驗(yàn)結(jié)果

2.2 CMN對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響 如表2所示，小鼠的初始體質(zhì)量在CMN各劑量組、陽性組與模型組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即小鼠的初始體質(zhì)量在各組間較為均衡。第14 d、30 d，各實(shí)驗(yàn)組與模型組小鼠體質(zhì)量相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)各組小鼠體質(zhì)量與正常組小鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 CMN對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量影響試驗(yàn)結(jié)果

2.3 CMN對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖的影響 如表3所示，試驗(yàn)前，各試驗(yàn)組均與模型組比較，正常組小鼠空腹血糖值明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，其他各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明造模成功，且各試驗(yàn)組間血糖值均一；試驗(yàn)后，各試驗(yàn)組與模型組比較，CMN高、中、低劑量組小鼠空腹血糖值明顯低于模型組（P＜0.01或P＜0.05）；試驗(yàn)前后各試驗(yàn)組血糖下降百分率與模型組比較，CMN各劑量組血糖下降百分率明顯大于模型組（P＜0.01或P＜0.05）。

表3 CMN對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖影響試驗(yàn)結(jié)果

2.4 CMN對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素水平及胰島病理學(xué)的影響 如表4所示，與模型組比較，正常組小鼠胰島β細(xì)胞陽性染色病理積分與INS水平明顯高于模型組（P＜0.01）；除CMN低劑量組血清INS水平外，CMN各劑量組可使糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞陽性染色病理積分與血清INS水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 CMN對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素水平及胰島病理學(xué)的影響

如圖1 A所示，正常組胰島細(xì)胞免疫組化染色均勻，境界清晰，胰島細(xì)胞橢圓型，胞漿豐富，核圓居中，胰島面積大，胰島細(xì)胞數(shù)量多、島內(nèi)細(xì)胞均勻分布；如圖1 B所示，糖尿病模型組胰島細(xì)胞免疫組化染色不均勻，胰島面積、胰島細(xì)胞數(shù)量明顯減少，島內(nèi)細(xì)胞尤其是中心部細(xì)胞明顯空泡化、減少，甚至消失；如圖1 C-F所示，各藥物組胰島細(xì)胞免疫組化染色比較均勻，胰島數(shù)量、面積有改善，胰島細(xì)胞邊界尚清晰，細(xì)胞排列尚規(guī)則、整齊，細(xì)胞致密度略增加。

3 討論

糖尿病是一種非傳染性慢性內(nèi)分泌代謝性疾病，多伴有并發(fā)癥。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們飲食結(jié)構(gòu)的變化，糖尿病患病率逐年增高。在2011年11月14日國際糖尿病日，國際糖尿病聯(lián)合會(huì)(IDF)的權(quán)威指南《Diabetes Atlas》新發(fā)布的數(shù)據(jù)表明，當(dāng)前全世界成年糖尿病人數(shù)已達(dá)3.66億人，到2030年，糖尿病患者將增至5.52億人。而我國20歲以上成人中，糖尿病患病率達(dá)到9.7%，我國以9240萬的患者人數(shù)成為世界糖尿病“第一大國”[8]。

糖尿病容易并發(fā)全身神經(jīng)、微血管、大血管病變，并可導(dǎo)致心、腦、腎、神經(jīng)及眼等組織器官的慢性進(jìn)行性病變，諸多并發(fā)癥日趨增多，程度加重，嚴(yán)重危害著患者健康和生命。對(duì)糖尿病的治療以飲食療法、運(yùn)動(dòng)療法和藥物療法為主。目前國內(nèi)外常用的降糖西藥有磺酰脲類，雙胍類，α-葡萄糖苷酶抑制劑及胰島素等，這些藥物療效確切，但不良反應(yīng)也往往比較嚴(yán)重。

圖1 CMN對(duì)糖尿病小鼠胰島病理學(xué)影響

中醫(yī)藥對(duì)糖尿病防治具有悠久的歷史，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，并形成獨(dú)特理論認(rèn)識(shí)。許多有效方藥可明顯改善糖尿病患者的“三多一少”癥狀，并可有效減少糖尿病的并發(fā)癥。糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”范疇，其病機(jī)主要為氣陰兩虛，燥熱偏盛，癖血阻滯等。廣西中醫(yī)藥大學(xué)鄧家剛教授，在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)糖尿病患者均表現(xiàn)不同程度的陰虛燥熱口渴與血脈瘀滯的癥狀，他主張治療糖尿病當(dāng)以“滋陰活血”為主，用藥以桑椹三七為主藥，隨癥加減，在長期的臨床實(shí)踐中形成了“復(fù)方桑椹三七”，方中君藥桑椹滋陰補(bǔ)腎，解除糖尿病患者口渴多飲多尿，臣藥三七益氣活血化瘀，改善患者微血管病變等各種并發(fā)癥，二藥合用滋陰活血兼顧，隨癥加減，臨床療效尚可。

本研究結(jié)果表明，CMN對(duì)STZ致糖尿病小鼠攝食量、飲水量、排尿量及空腹血糖具有明顯降低作用，這可能與其保護(hù)胰島β細(xì)胞，恢復(fù)胰島素的分泌水平相關(guān)。本研究為CMN后期產(chǎn)品開發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。

[1] 王瑞坡．桑椹黃酮的制備及其降血糖和降尿酸作用研究[D]．上海：華東師范大學(xué)，2011．

[2] 田春雨，薄海美，李繼安．桑椹多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠血糖及血脂的影響[J]．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(10)：158-160．

[3] 王瑞坡,王珂，李姣，等．桑椹乙酸乙酯萃取物對(duì)鏈脲佐菌素致高血糖大鼠的降血糖作用[J]．中成藥，2011，33(10)：1668-1672．

[4] 孫迎慶．三七總苷對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的影響[J]．河南中醫(yī)，2009，29(12)：1234．

[5] 杜月光，柴可夫，楊明華，等．三七皂苷對(duì)糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中國中醫(yī)藥科技，2010，17(1)：40-41．

[6] 侯少貞，蔣東旭，謝芳一，等．三七水提物治療2型糖尿病大鼠的實(shí)驗(yàn)研究[J]．廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，27(4)：404-408．

[7] 黃雨山．保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范實(shí)施手冊(cè)[S]．4卷．北京：中科多媒體電子出版社，2003：711-716．

[8] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)．中國2型糖尿病防治指南（2010年版）［M］．北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2011：6-17．

Objective To study the effects of Compound mulberry fruit notoginseng (CMN) on blood glucose and islet pathology in streptozotocin(STZ)-induced diabetic mice. Methods Kunming mice, SPF, male, were adopted in this test. Diabetic mouse model was induced by STZ (150 mg/kg), given by intraperitoneal injection. 50 mice, whose blood glucose ranged from 11-25 mmol/L, were randomly divided in to 5 groups, such as model group, glibenclamide group(5 mg/kg) and CMN high-, middle-, low-dose group（9.0,3.0,1.5 g/kg）. Another ten normal mice were taken as control group. After administration for 30 days, diet, voided volume, weight, insulin levels, and fasting blood glucose of the mice were observed, and pancreatic β cells were immuno-stained for pathological observation. Results The results showed that there were signif i cant difference (P＜0.01 or P＜0.05) in food, water intake, voided volume, insulin levels, and fasting plasma glucose between drug group and model group. Pathological sections showed that CMN increased positive immuno-stained pancreatic β cells, and the pathological lesions improved markedly, With data， Food intake: Normal group is (5.13±0.67), Model group is (8.91±0.81), Glibenclamide group is (6.6±0.83), CMN high dose group is (4.56±0.89), CMN medium dose group is (6.63±0.49), CMN low dose group is (8.26±0.92); Water intake：Normal group is (6.21±0.59), Model group is (21.95±5.58), Glibenclamide group is (13.13±1.73), CMN high dose group is (10.19±2.00), CMN medium dose group is (13.45±2.82), CMN low dose group is (16.80±5.68)；The quantity of urine: Normal group is (4.17±0.49) , Model group is (20.31±4.97), Glibenclamide group is (11.38±1.98), CMN high dose group is (9.63±2.13), CMN medium dose group is (12.49±2.79), CMN low dose group is (15.53±5.66)；Fasting blood glucose (30 th days)：Normal group is (4.91±0.89, Model group is (20.58±6.69), Glibenclamide group is (12.71±6.60), CMN high dose group is (11.73±3.55), CMN medium dose group is (12.52±6.78), CMN low dose group is (14.28±5.57)；The serum level of insulin: Normal group is (10.12±1.27), Model group is (4.68±1.29), Glibenclamide group is (6.80±1.54), CMN high dose group is (6.23±1.62), CMN medium dose group is (5.93±1.12), CMN low dose group is (5.72±0.97)；Islet pathology score: Normal group is (2.90±0.54), Model group is (1.00±0.82), Glibenclamide group is (2.00±0.77), CMN high dose group is (2.40±0.49), CMN medium dose group is (2.10±0.83), CMN low dose group is (1.90±0.54）. Conclusion CMN signif i cantly reduces food, water intake, voided volume, insulin levels, and fasting plasma glucose on STZ-induced diabetic mice. This may be ascribe to its function of protecting the pancreatic β cells and restore the insulin secretion.

Mulberry fruit; Notoginseng; Mouse;Streptozotocin; Diabetes

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.29.004

廣西國際合作項(xiàng)目（桂科合14125007-2-10）；廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室課題（10-046-04-K 6；13-051-06-K 1）

廣西 530001 廣西中醫(yī)藥大學(xué)新藥研究開發(fā)中心（杜正彩） 廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西中醫(yī)藥大學(xué)（鄧家剛 黃慶 龐國鳳 李好文）通訊作者：鄧家剛 E-mail:dengjg@tom.com