范秀秀

XRCC 2和XRCC 3在大腸癌及大腸息肉中表達(dá)的臨床意義

范秀秀

目的 對(duì)大腸癌和大腸息肉中X射線交叉互補(bǔ)修復(fù)基因2（X-ray repair cross-complementing gene 2,XRCC 2）和X射線交叉互補(bǔ)修復(fù)基因3（XRCC 3）所編碼的蛋白檢測(cè)，探討二者在大腸癌及大腸息肉中的作用，評(píng)價(jià)其作為早期診斷和預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)志的可能性。方法 選取手術(shù)切除確診為大腸癌并未做放療、化療的標(biāo)本218例；選取電子結(jié)腸鏡下采集、病理證實(shí)為大腸腺瘤性息肉的標(biāo)本33例，另取36例基本正常的大腸黏膜標(biāo)本作為對(duì)照，通過免疫組化的方法，觀察XRCC 2、XRCC 3所編碼蛋白的表達(dá)。結(jié)果 (1)XRCC 2蛋白、XRCC 3蛋白在大腸癌的表達(dá)分別為80．28%（175/218）、74．77%（163/218），顯著高于息肉組的表達(dá)率57．58%（19/33）、54．55%（18/33）和正常黏膜組27．78%（10/36）、25%（9/36）（P＜0．05），息肉組蛋白表達(dá)顯著高于正常黏膜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），在直腸癌的表達(dá)率分別為81．74%（94/115）、79．13%（91/115），左半結(jié)腸癌的表達(dá)率分別為92．19%（59/62）、79．03%（49/62），均高于息肉組，右半結(jié)腸癌的表達(dá)率分別為62．86%（22/41）、56．10%（23/41），與息肉組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(2)癌組織中XRCC 2和XRCC 3蛋白的表達(dá)呈明顯正相關(guān)關(guān)系（P＜0．05）。結(jié)論 XRCC 2及XRCC 3蛋白表達(dá)在大腸癌、大腸腺瘤性息肉中上調(diào)，在不同的大腸癌部位有不同的影響，同時(shí)二者可能具有協(xié)同作用，因此聯(lián)合檢測(cè)XRCC 2、XRCC 3有助于診斷和預(yù)警大腸癌。

大腸癌；腺瘤性息肉；X射線交叉互補(bǔ)修復(fù)基因2；X射線交叉互補(bǔ)修復(fù)基因3

大腸癌發(fā)病率在全球各種腫瘤中居第3位。絕大部分大腸癌是由腺瘤或經(jīng)過一定的腺瘤期演變而來，通過對(duì)人群進(jìn)行結(jié)腸鏡篩查和高危人群的結(jié)腸鏡追蹤，以及息肉的內(nèi)鏡切除，可使大腸癌的發(fā)生率下降80%，病死率下降70%[1-2]。

研究大腸癌發(fā)生和發(fā)展中DNA損傷方式和修復(fù)機(jī)制有助于腫瘤的早期診斷并采取有效的干預(yù)手段。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于X射線交叉互補(bǔ)修復(fù)基因2(X-ray repair cross-complementing gene 2，XRCC 2)及X射線交叉互補(bǔ)修復(fù)基因3(XRCC 3)基因的研究多局限于單核苷酸多態(tài)性與腫瘤易感性之間的關(guān)系，而對(duì)大腸癌和息肉中蛋白的表達(dá)情況鮮有報(bào)道，缺乏從腺瘤→癌的系統(tǒng)的聯(lián)合對(duì)比性研究資料。本研究旨在通過對(duì)大腸癌和大腸息肉中兩種基因的蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)，探討二者在大腸癌及大腸息肉中的作用，評(píng)價(jià)其作為早期診斷和預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)志的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取臺(tái)州市臺(tái)州醫(yī)院、溫嶺市第一人民醫(yī)院2006年1月～2010年8月手術(shù)切除確診為大腸癌并未做放療、化療的標(biāo)本218例，患者男118例，女100例；年齡27～88歲，平均（62.72±8.03）歲；其中直腸癌115例，左半結(jié)腸癌62例，右半結(jié)腸41例。

選取2007年3月～2008年12月電子結(jié)腸鏡下采集、病理證實(shí)為大腸腺瘤性息肉的標(biāo)本33例。另取36例因有腸道癥狀行結(jié)腸鏡檢查的基本正常的大腸黏膜標(biāo)本作為對(duì)照。通過免疫組化的方法，觀察同源重組修復(fù)基因XRCC 2、XRCC 3的蛋白表達(dá)情況。分析這兩種蛋白的表達(dá)與腫瘤發(fā)病的關(guān)系。

1.2 免疫組化染色 標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm連續(xù)切片，行常規(guī)蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，選擇細(xì)胞狀態(tài)良好處，用已知染色陽性大腸癌細(xì)胞切片作陽性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）取代一抗作陰性對(duì)照。免疫組化試劑鼠抗人XRCC 2、XRCC 3單克隆抗體，SP試劑盒二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色劑：均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，為美國(guó)Zymed公司產(chǎn)品。按試劑說明書推薦的染色方法進(jìn)行染色。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)[3]免疫組化染色后，顯微鏡下觀察切片細(xì)胞中棕黃色顆粒的出現(xiàn)情況。陽性表達(dá)以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為準(zhǔn)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野或500個(gè)細(xì)胞，按照染色強(qiáng)度計(jì)分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕揭色；按陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞占10%，2分為陽性細(xì)胞占11%～50%，3分為陽性細(xì)胞占51%～75%，4分為陽性細(xì)胞＞75%。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分乘積3分以上記為陽性，否則為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 XRCC 2和XRCC 3蛋白的表達(dá)情況

2.1.1 XRCC 2和XRCC 3蛋白在大腸癌、息肉和正常大腸黏膜組織的表達(dá) XRCC 2蛋白主要在上皮細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。該蛋白在大腸癌的表達(dá)顯著高于息肉組及正常黏膜組（P＜0.05），息肉組蛋白表達(dá)顯著高于正常黏膜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。XRCC 3蛋白主要在上皮細(xì)胞核表達(dá)。該蛋白在大腸癌的表達(dá)顯著高于息肉組及正常黏膜組（P＜0.05），息肉組蛋白表達(dá)顯著高于正常黏膜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1 癌、息肉和正常大腸黏膜組織XRCC 2和XRCC 3蛋白的表達(dá)

2.1.2 XRCC 2和XRCC 3蛋白表達(dá)與大腸癌部位之間的關(guān)系 XRCC 2蛋白的表達(dá)在直腸癌和右半結(jié)腸癌之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，直腸癌和左半結(jié)腸癌之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。XRCC 2蛋白的表達(dá)在直腸癌、左半結(jié)腸癌和右半結(jié)腸癌的表達(dá)率均高于息肉，右半結(jié)腸癌與息肉組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。XRCC 3蛋白的表達(dá)在直腸癌和右半結(jié)腸癌之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，直腸癌和左半結(jié)腸癌之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。XRCC 3蛋白的表達(dá)在直腸癌、左半結(jié)腸癌的表達(dá)率高于息肉，右半結(jié)腸癌與息肉組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。

表2 XRCC 2和XRCC 3蛋白表達(dá)與大腸癌部位之間的關(guān)系

2.2 XRCC 2與XRCC 3蛋白的表達(dá)相關(guān)性 癌組織中XRCC 2和XRCC 3蛋白的表達(dá)呈明顯正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05，見表3)。

表3 癌組織中XRCC 2與XRCC 3蛋白的表達(dá)（n）

3 討論

人類XRCC 2和XRCC 3基因是RAD 51基因的家族成員，與RAD 51基因具有20%～30%的序列同源性，兩種基因編碼的蛋白功能相似，所以又被稱為RAD 51類似體。XRCC 2和XRCC 3蛋白可以與其他幾種RAD 51類似體在細(xì)胞中形成復(fù)合物：RAD 51 B-RAD 51 C-RAD 51 D-XRCC 2異四聚體和RAD 51 D-XRCC 2、RAD 51 C-XRCC 3異二聚體，通過參與同源重組來修復(fù)DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks，DSB）和交聯(lián)損傷，維持基因組的穩(wěn)定和細(xì)胞的正常功能。XRCC 2/ XRCC 3基因的缺陷或蛋白的缺失可導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)減少，腫瘤的發(fā)生率增加。已有研究[4]證實(shí)，XRCC 2或XRCC 3基因突變的細(xì)胞中，特定部位的DNA雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)降低25～250倍；研究顯示XRCC 3蛋白缺失誘導(dǎo)自發(fā)性的DSB形成并抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF 7的增殖[5]。 XRCC 2和XRCC 3蛋白通過促進(jìn)RAD 51的聚集、DNA鏈解螺旋以及單鏈交換來修復(fù)DNA損傷[6-7]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道[8]RAD 51 C-XRCC 3 復(fù)合物在同源重組晚期促進(jìn)重組中間體的溶解從而發(fā)揮DNA損傷修復(fù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌病例中，XRCC 2和XRCC 3蛋白的表達(dá)率分別為80.28%和75.24%，明顯高于息肉組織與正常大腸黏膜，提示二者可能與大腸癌的發(fā)生和發(fā)展有一定關(guān)系。XRCC 2和XRCC 3蛋白的表達(dá)上調(diào)可能由于癌細(xì)胞在不斷增殖、進(jìn)行DNA復(fù)制的過程中產(chǎn)生大量的DSB，并誘導(dǎo)XRCC 2和XRCC 3蛋白參與的同源重組修復(fù)反應(yīng)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于XRCC 2和XRCC 3蛋白在大腸癌中表達(dá)情況的報(bào)道較少，研究多為XRCC 2和XRCC 3基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與腫瘤易感性之間的關(guān)系。目前研究認(rèn)為XRCC 2基因Arg 188 His的多態(tài)可增加個(gè)體乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Jin等[9]對(duì)中國(guó)漢族人群進(jìn)行的研究，Giuseppina等[10]對(duì)意大利南部人群進(jìn)行的研究均表明，XRCC 3基因Thr 241 Met的多態(tài)增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。但文獻(xiàn)中亦有相反結(jié)果的報(bào)道出現(xiàn)。我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)進(jìn)行的研究、Camilla等對(duì)挪威地區(qū)人群以及Victor等[11-13]的研究結(jié)果顯示，XRCC 3 241密碼子多態(tài)性與結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)無顯著關(guān)聯(lián)。目前有關(guān)XRCC 2和XRCC 3基因單核苷酸多態(tài)性方面的研究結(jié)果存在著較大差異，可能與試驗(yàn)人群、腫瘤類型及環(huán)境因素相互作用共同影響腫瘤易感性，另外，樣本大小不同也可能是造成結(jié)果存在差異的原因。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同部位的大腸癌XRCC 2和XRCC 3蛋白表達(dá)情況有差異，直腸癌和左半結(jié)腸癌中兩種蛋白的表達(dá)上調(diào)，顯著高于右半結(jié)腸癌的表達(dá)率，表明兩種蛋白對(duì)直腸癌和左半結(jié)腸癌發(fā)生的關(guān)系更為密切，更具有診斷和預(yù)警意義。大多數(shù)學(xué)者[14-15]的研究結(jié)果顯示，大腸息肉及大腸癌均主要分布于直腸和乙狀結(jié)腸，并且很多解剖亦證實(shí)了這一點(diǎn)。孫婷等[16]報(bào)道直腸、乙狀結(jié)腸息肉癌變發(fā)生率高于其他部位，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此直腸、乙狀結(jié)腸為息肉癌變的好發(fā)部位。本研究觀察到不同部位的大腸癌中XRCC 2和XRCC 3蛋白的表達(dá)有差異，提示兩種蛋白可能對(duì)于不同部位的大腸息肉惡變的影響不同，對(duì)于左半結(jié)腸和直腸息肉惡變的作用更大，分析其機(jī)制可能與大腸各部位的生理功能和菌群分布的不同有關(guān)。右半結(jié)腸的生理功能主要為吸收水和電解質(zhì)，而左半結(jié)腸和直腸貯存和排出糞便，大腸黏膜與糞便中輔助致癌物的接觸時(shí)間及被細(xì)菌作用的時(shí)間較長(zhǎng)，更易引起DNA損傷從而誘導(dǎo)修復(fù)反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道[17]，一些可能和產(chǎn)生致（促）癌物有關(guān)的膳食因素與左半結(jié)腸癌的相關(guān)性較顯著，而右半結(jié)腸癌的發(fā)生可能與膳食因素的相關(guān)性較弱，支持上述分析。XRCC 2和XRCC 3蛋白在癌組織中的表達(dá)呈明顯正相關(guān)關(guān)系，提示二者在DNA損傷的同源重組修復(fù)中可能具有協(xié)同作用。

XRCC 2與XRCC 3蛋白在大腸癌中的高表達(dá)率可能為診斷和預(yù)警大腸癌提供新的依據(jù)。但是大腸癌和大腸息肉中兩種蛋白的表達(dá)上調(diào)對(duì)于各自組織的具體作用還有待于進(jìn)一步研究，例如有表達(dá)和無表達(dá)的大腸息肉惡變的機(jī)率有無差異？大腸癌中蛋白的表達(dá)是否影響放療或化療效果？對(duì)兩種蛋白的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)會(huì)有怎樣的現(xiàn)象出現(xiàn)？這些都是目前尚未研究清楚的問題，將在今后的工作中逐步進(jìn)行研究和分析。

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Objective To explore the role in colorectal cancinoma and polypus by detecting the protein expression of XRCC 2, XRCC 3 , and evaluate its possibility as a biological marker for early diagnosis and prognosis. Methods Colorectal carcinoma with clear pathological diagnosis from 218 patients were collected. Immunohistochemistry was used to detect the protein expressions of XRCC 2 and XRCC 3 in carcinoma group of all the patients and in polypus group of 33 patients, normal group of 36. Results 1 the protein expression of XRCC 2, XRCC 3 of colorectal carcinoma was signif i cantly higher than polypus group and normal group (P＜0.05), the polypus group signif i cantly higher than the normal group (P＜0.05), colorectal carcinoma and the left colon carcinoma signif i cant than polypus, there were no signif i cant difference between right colon carcinoma and polypus; 2 The protein expression of XRCC 2 and XRCC 3 was positively correlated in carcinoma (P＜0.05). Conclusion The expression levels of XRCC 2 and XRCC 3 in colorectal carcinoma, polypus were up-regulated, have different effects in different parts of the colorectal carcinoma , and may have a synergistic effect, therefore it may be helpful to detect the protein expressions of both XRCC 2 and XRCC 3 for the diagnosis and predication of colorectal carcinoma.

Colorectal carcinoma; Polypus; X-ray repair cross-complementing gene 2; X-ray repair cross-complementing gene 3

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.29.001

浙江 317500 溫嶺市第一人民醫(yī)院 (范秀秀)