房新苗

馬尾松樹皮提取物對順鉑所致體外人胚腎細胞毒性的保護作用

房新苗

目的 體外研究馬尾松皮提取物（PMBE）對于順鉑（CDDP）所致人胚腎細胞毒性保護作用及其作用機制。方法 體外進行人胚腎細胞293（HEK293）的培養(yǎng)，分別應用PMBE和CDDP進行處理，并以四甲基偶氮噻唑藍（MTT）檢測細胞生長情況；同時檢測細胞中丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）的含量。結果 低濃度（≤80mg/L）PMBE可促進HEK293細胞的生長，提高細胞GSH的含量，降低MDA和ROS的含量；在較高濃度下可產生輕微的細胞毒性。結論 低濃度PMBE對于CDDP所致腎毒性具有一定的保護作用，作用機制與其抗氧化性有關。

順鉑；腎毒性；人胚胎腎細胞；馬尾松皮提取物；抗氧化性

順鉑（CDDP）是臨床常用抗腫瘤藥物，廣泛應用于治療各類實體瘤，但其有較明顯的腎毒性，臨床應用受到限制[1]。CDDP的腎毒性發(fā)生機制目前尚未闡明，多認為與過氧化反應有關[2]。馬尾松皮提取物（PMBE）是一類提取自松樹皮的物質，其主要活性成分原花青素屬于黃酮類物質，抗氧化性極強，且具有氧自由基清除能力。故認為PMBE可能抑制CDDP所致過氧化反應，從而起到腎毒性保護作用[3]。本研究取人胚腎細胞HEK293進行體外研究，旨在探討PMBE對于CDDP所致腎毒性的保護作用及作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料 PMBE選自廣東省嵩珍營養(yǎng)研究所，以DMSO配置成為100g/L的貯存液，經過濾膜過濾后置于-20℃下儲存待用。順鉑（純度＞95%）選自南京制藥廠有限公司，以PBS配置溶液后過濾封存。人胚腎細胞HEK293選自中國協和醫(yī)科大學；過氧化氫酶（CAT）及活性氧（ROS）檢測試劑均選自碧云天生物技術研究所；維生素C（VitC）、青鏈霉素、DMEM、胎牛血清（FBS）選自Gibco公司；胰島素及NADPH選自深圳普博科技有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒選自南京建成生物工程研究所。

1.2 胞培養(yǎng)及細胞毒性試驗

1.2.1 細胞培養(yǎng) HEK293細胞以1%青鏈霉素和10% FBS DMEM培養(yǎng)液置于CO2培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 CDDP毒性 取對數生長期細胞進經消化吹打為單細胞懸液后接種，加入不同濃度（0、0.015、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48、0.96、1.92及3.84mmol/L）的CDDP培養(yǎng)24h，然后采用MTT比色法[2]測定490nm處吸光度（A）。細胞存活率以

A實驗/A0×100%表示。

1.2.3 PMBE作用 按照上述方法再次培養(yǎng)細胞直至融合狀態(tài)，加入濃度不同的PMBE（0、20、40、60、80、100、120、140、160和180mg/L）培養(yǎng)48h，以MTT法測定A值，觀察PMBE對于HEK293細胞生長情況的影響。按照上述方法以PMBE進行細胞培養(yǎng)24h，加入IC50的CDDP進行處理24h，同樣采用

MTT法測定A值。

1.3 氧化指標檢查方法 取對數期生長HEK293細胞進行接種生長至融合狀態(tài)，然后加入不同濃度（同1.2.3）的PMBE和100mg/K VitC（模型組）培養(yǎng)24h，加入IC50的CDDP進行處理24h。以DCF熒光法進行細胞中ROS水平的測定。并取培養(yǎng)后的細胞配置為細胞懸液，經離心分離后進行PBS凍融處理，再次離心分離后，測定細胞中GSH、MDA含量。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有數據采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行處理，正態(tài)計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CDDP的腎毒性作用 MTT法測定顯示，隨著CDDP濃度的升高，HEK293細胞抑制率提高，并存在顯著劑量依賴性（如圖1）。

圖1 CDDP對于HEK293的毒性作用(aP＜0.05)

2.2 PMBE對于HEK293存活率的影響 PMBE≤100mg/ L對細胞生長具有促進作用，在60mg/L時達到峰值，＞100mg/L時細胞的存活率降低，但仍＞90%（如圖2）。

圖2 PMBE對于HEK293存活率的影響（aP＜0.05）

2.3 PMBE對于CDDP所致HEK293毒性的影響 與正常組（未加CDDP及PMBE）比較，模型組的HEK293存活率顯著降低，加入PMBE后存活率逐漸升高，PMBE80mg/L時達到峰值，此后逐漸降低，濃度≥140mg/L時不再具有保護作用（如圖3）。

圖3 PMBE對于CDDP所致HEK293毒性的影響（aP＜0.05）

2.4 PMBE對于HEK293損傷細胞GSH及MDA含量的影響 模型組的GSH低于對照組，損傷HEK293細胞經PMBE處理后，GSH有上升趨勢，在80mg/L時達到峰值，此后逐漸降低；而細胞中MDA呈降低趨勢，在80mg/L使達到谷值，此后逐漸升高（如圖4）。

圖4 PMBE對于HEK293損傷細胞GSH及MDA含量的影響（aP＜0.05）

2.5 PMBE對于HEK293損傷細胞ROS的影響 模型組的ROS含量較對照組顯著升高，經PMBE處理后，細胞中ROS含量呈降低趨勢，在80mg/L時達谷值，此后逐漸升高（如圖5）。

圖5 PMBE對于HEK293損傷細胞ROS的影響（aP＜0.05）

3 討論

CDDP具有強效抗癌作用，多用于實體瘤的治療，但其腎毒性限制了臨床應用。相關研究表明，CDDP在進入體內后，主要是經腎臟代謝排出，可產生大量的活性氧自由基，造成氧化應激性反應[3]。氧自由基能夠直接作用于細胞膜以及各細胞器膜，誘發(fā)脂質過氧化，從而導致細胞中的腎皮巰基的含量減少，而MDA含量升高。MDA含量可作為脂質過氧化強度的反應指標，在急性損傷時，細胞MDA水平將顯著升高[4]。GSH是一種非蛋白巰基，當各類化學毒物損傷腎細胞時，可導致大量的GSH消耗而導致其細胞含量急劇降低[5]。

PMBE具有較強的抗氧化能力以及自由基清除能力，基于對CDDP所致腎毒性的認識，認為PMBE可能對CDDP的腎毒性具有保護性作用[4]。故本研究建立了CDDP人胚HEK293細胞損傷模型，以PMBE、VitC進行處理和對照分析，探討PMBE對于CDDP所致細胞腎毒性的影響。研究結果顯示，CDDP損傷HEK293細胞在經PMBE處理后，MDA和ROS在PMBE濃度上升至80mg/L時達到谷值，此后逐漸升高。而細胞中GSH含量有升高趨勢，濃度為80mg/L時GSH含量升高至峰值，此后逐漸降低，與王秋月[5]等報道結果一致。PMBE對于HEK293存活率的影響研究顯示，PMBE≤100mg/L對細胞生長具有促進作用，在60mg/L時達到峰值，＞100mg/L時細胞的存活率降低。認為低濃度（≤80mg/L）對于CDDP所致腎毒性具有保護作用，高劑量（＞80mg/L）時保護程度將逐漸降低，濃度＞140mg/L時可與CDDP產生腎毒性疊加作用。

綜上所述，一定劑量（≤140mg/L）的PMBE能夠通過清除氧自由基、抗氧化等作用而對CDDP所致腎細胞毒性起到保護作用，而＞140mg/L的PMBE能夠誘導癌細胞的凋亡，但關于其與CDDP聯合用藥后是否能夠降低CDDP用量或者起到療效協同作用，還有待進一步研究。

[1] 曹軍，姜麗平，耿成燕，等.硼酸對順鉑致體外人胚腎細胞毒性保護作用[J].中國公共衛(wèi)生，2008，24(11)：1326-1327.

[2] 李昱辰，仲來福.維生素E琥珀酸脂對順鉑致人胚腎細胞毒性的保護作用[J].環(huán)境與健康雜志，2012，29(3)：232-234.

[3] 郭培培，郭豫，高麗萍，等.促紅細胞生成素對順鉑誘導HEK-293細胞毒性的保護作用[J].江蘇醫(yī)藥，2013，39(18)：2126-2128，封3.

[4] 馮冬茹，李琳，謝衡，等.馬尾松樹皮提取物對癌細胞內硫氧還蛋白還原酶的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23(10)：2480-2482.

[5] 王秋月，郁建平，蔡立，等.馬尾松樹皮中原花青素體外抗自由基作用的研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31(8)：81-83.

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.20.009

廣東 525000 茂名市中醫(yī)院藥劑科（房新苗）