王 芳 姜 靜

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，黑龍江 哈爾濱 150040)

轉(zhuǎn)基因是獲得植物新品種的方法之一，人們常采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法來獲得成功的林木轉(zhuǎn)化子[1-4]，迄今為止，育種學(xué)家已利用該方法獲得了抗逆、早花等性狀的轉(zhuǎn)基因株系[5-7]。然而在植物轉(zhuǎn)基因的篩選過程中，抑菌抗生素和選擇抗生素種類及濃度的確定是轉(zhuǎn)基因成功的關(guān)鍵，因?yàn)橐志股卦谝种妻r(nóng)桿菌的同時(shí)也對植物細(xì)胞產(chǎn)生傷害作用，抑制植物受體細(xì)胞的分化，從而影響植株的再生[8]。研究表明，遺傳轉(zhuǎn)化中所用的農(nóng)桿菌主要有EHA4404、EHA105和AGL1等[3,5,7,9]，不同種類的農(nóng)桿菌對抗生素的敏感程度有差異，植物表達(dá)載體攜帶的外源基因不同也可能影響抑菌抗生素的使用劑量和種類[3,10-14]。因此，在利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法開展植物轉(zhuǎn)基因之前，必須對供試植物受體進(jìn)行抗生素敏感試驗(yàn)，篩選抑菌效果好同時(shí)又對供試植物再生影響小的抗生素作為抑菌劑，并確定其最佳使用濃度，才能保證其既能抑制農(nóng)桿菌的生長，又能使轉(zhuǎn)化細(xì)胞正常再生。

選擇劑在遺傳轉(zhuǎn)化中主要用于篩選轉(zhuǎn)化體和檢測轉(zhuǎn)基因后代，其濃度的高低直接影響轉(zhuǎn)化效率。濃度過高，抑制成功轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長，濃度過低又會(huì)形成大量假陽性抗性愈傷和嵌合體。因此，為獲得最佳的篩選效果，確定合適的選擇劑濃度，有必要在轉(zhuǎn)化試驗(yàn)之前，對植物受體進(jìn)行選擇抗生素的敏感試驗(yàn)。

紫雨樺(Betulapendula‘Purple Rain’)是歐洲白樺種內(nèi)變種，葉片紫色，已經(jīng)成為重要的觀賞樹種。本研究團(tuán)隊(duì)采用Solexa技術(shù)對紫雨樺及歐洲白樺(Betulapendula)基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，紫雨樺中顯著上調(diào)的基因有：編碼苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸羥化酶、花色素合成酶和花色苷-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶等基因[15]。為了查明歐洲白樺變種(紫雨樺)葉片呈現(xiàn)紫色的原因，必須通過轉(zhuǎn)基因手段進(jìn)行基因的功能驗(yàn)證。本試驗(yàn)以紫雨樺為研究對象，分別進(jìn)行適宜的抑菌劑和選擇劑篩選，為開展紫雨樺基因功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

紫雨樺無菌苗。材料取自黑龍江省森林植物園，摘取紫雨樺腋芽置于70%乙醇中1 min，隨后用無菌水浸泡1 min，于超凈臺(tái)上剝?nèi)ネ鈱友亏[，隨后在10%(W/V)Ca(ClO)2中處理10 min，期間不斷攪動(dòng)，最后用無菌水漂洗3～5遍。將消毒后的腋芽接種到WPM + 1.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)+ 0.5 mg/L GA3的初始培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d后，即可獲得叢生不定芽。

1) 菌種：農(nóng)桿菌EHA105(pCHS )，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2) 抗生素：卡那霉素(kanamycin, Kan)、新霉素(neomyxin)均購自Sigema公司；潮霉素(hygromycin)購自amresco公司；G418購自Invitrogen Corporation；頭孢霉素(cefalotin, Cef)購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；頭孢曲松鈉(ceftriaxone sodium)購自上海新先鋒藥業(yè)有限公司；羧芐青酶素(carbenicillin, Carb)購自Bedfont Limited；特美汀(Ticarcillin Clavulanate Acid)購自中科瑞泰(北京)生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

活化農(nóng)桿菌EHA105(pCHS )的菌種至對數(shù)期[16]，隨后菌液與50 ℃左右的LB固體培養(yǎng)基以1∶100的比例混勻，倒平板。無菌條件下用直徑為1 cm 的無菌濾紙片蘸取不同種類和濃度的抑菌抗生素置于平板上，28 ℃下暗培養(yǎng)，3 d后觀察抑菌圈的大小。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)置抑菌抗生素(頭孢霉素、頭孢曲松鈉、羧芐青霉素、特美汀)的濃度范圍均為：200～800 mg/L，對照組CK不加抗生素[17-19]。

將不定芽轉(zhuǎn)接于WPM + 0.4 mg/L IBA生根培養(yǎng)基中， 25 d后切除根部再次轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d，取苗木頂部的第2片或第3片葉片于培養(yǎng)皿中。延與主葉脈垂直的方向從靠近葉柄處切一刀，形成2片有創(chuàng)口的葉片，置于附加不同種類和濃度抑菌抗生素、選擇抗生素的分化培養(yǎng)基上，每處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)約5片紫雨樺完整葉片(10片有創(chuàng)口的葉片)，在溫度為(25±2) ℃，光照時(shí)間為16 h/d，光照度 1 500～2 000 lx的條件下培養(yǎng)，定期觀察葉片的變化及愈傷組織誘導(dǎo)情況，培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生愈傷的葉片個(gè)數(shù)并計(jì)算愈傷產(chǎn)生率(愈傷產(chǎn)生率=產(chǎn)生愈傷的葉片數(shù)/總?cè)~片數(shù)×100%)。抑菌抗生素的種類及濃度與上述相同，選擇抗生素種類與濃度范圍分別為卡那霉素：10～40 mg/L；G418：5～20 mg/L；新霉素：10～50 mg/L；潮霉素：5～20 mg/L ；對照組CK不加抗生素[17-18,20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌抗生素對農(nóng)桿菌的抑制作用

將蘸有不同濃度頭孢霉素、頭孢曲松鈉、羧芐青霉素、特美汀的濾紙片置于含有LB的平板上，觀察抑菌圈的大小，結(jié)果見表1。當(dāng)抗生素濃度在200 mg/L時(shí)，含有頭孢霉素、頭孢曲松鈉和特美汀的LB平板上均出現(xiàn)抑菌圈，說明已經(jīng)產(chǎn)生了抑菌效果，只有附有羧芐青霉素的平板上沒有出現(xiàn)抑菌圈。隨著抗生素濃度的增大，抑菌圈的半徑逐漸增大，其中，特美汀的變化最明顯，最小的抑菌圈為0.1～0.2 cm，最大則可達(dá)到0.8～1.0 cm。頭孢霉素與頭孢曲松鈉作用下的抑菌圈變化比較平緩。羧芐青霉素的濃度在200～600 mg/L時(shí)，一直沒有出現(xiàn)抑菌圈，只有在800 mg/L時(shí)才出現(xiàn)0.2～0.5 cm的抑菌圈，較其他3種抗生素抑菌效果不明顯。綜上研究結(jié)果表明：頭孢霉素、頭孢曲松鈉、特美汀對農(nóng)桿菌EHA105(pCHS)有較好的抑制作用，以0.2～0.5 cm的抑菌圈為基準(zhǔn)，認(rèn)為此時(shí)可達(dá)到明顯的抑菌效果。由表1可知，對農(nóng)桿菌有較好抑制作用的3種抗生素的濃度分別為：頭孢霉素200～400 mg/L，頭孢曲松鈉200～600 mg/L，特美汀400～800 mg/L。

表1 不同種類、濃度的抑菌抗生素 對農(nóng)桿菌的抑制試驗(yàn)結(jié)果

2.2 抑菌抗生素對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將紫雨樺葉片分別接種到含不同濃度的頭孢霉素、頭孢曲松鈉、羧芐青霉素、 特美汀的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織形成率，見圖1。圖1表明：在設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，頭孢霉素、羧芐青霉素、特美汀對葉片的毒害作用較小，這3種抗生素的愈傷形成率均在55%以上，只有頭孢曲松鈉對離體葉片愈傷形成的影響略大，隨著濃度的增大，愈傷形成率逐漸降低，當(dāng)濃度達(dá)到800 mg/L時(shí)，不再產(chǎn)生愈傷組織，即愈傷形成率為0。以愈傷形成率在50%以上認(rèn)為是對葉片傷害較小為基準(zhǔn)，由圖1可知：200～800 mg/L的頭孢霉素、羧芐青霉素、特美汀或200～400 mg/L的頭孢曲松鈉對紫雨樺葉片愈傷的形成影響不大。結(jié)合上述抑菌劑的抑菌效果選出既能有效抑制農(nóng)桿菌的生長又對離體葉片產(chǎn)生最小傷害的抑菌劑，認(rèn)為頭孢霉素、頭孢曲松鈉和特美汀可作為紫雨樺遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中適宜的抑菌抗生素，其適宜濃度范圍分別為：頭孢霉素200～400 mg/L，頭孢曲松鈉200～400 mg/L，特美汀400～800 mg/L。

2.3 選擇抗生素對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將切好的紫雨樺葉片置于含有不同種類及濃度選擇劑的愈傷培養(yǎng)基平板上，25 d后觀察愈傷的形成率(表2)。由表2可知：隨著選擇劑濃度的增大，愈傷形成率逐漸降低。葉片對G418與潮霉素較敏感，當(dāng)G418、潮霉素濃度為 15 mg/L 時(shí)，葉片愈傷形成率均為0。而卡那霉素在30 mg/L時(shí)，愈傷形成率才為0，新霉素在所設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，始終都有愈傷形成，因此不宜作為紫雨樺遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的選擇劑。綜上結(jié)果表明：卡那霉素、G418、潮霉素都可作為紫雨樺遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的選擇劑，卡那霉素的臨界濃度為30 mg/L，G418和潮霉素的臨界濃度為15 mg/L。

表2 不同種類、濃度選擇抗生素下離體葉片愈傷形成率

3 結(jié)論與討論

在植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，農(nóng)桿菌侵染后為了避免菌體泛濫，必須采用抑菌抗生素進(jìn)行抑菌，常用的抑菌抗生素有頭孢類、羧芐青霉素、特美汀等[20]。不同種類、濃度的抑菌劑對農(nóng)桿菌(含外源基因)的抑菌效果不同[21-23]，因此，選擇適宜的抑菌劑并確定其最佳濃度范圍在轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)中是非常必要的。同時(shí)，試驗(yàn)中所用的工程菌雖然均是農(nóng)桿菌，但由于內(nèi)含不同的重組外源基因的質(zhì)粒載體，有可能導(dǎo)致含不同載體的農(nóng)桿菌對不同抑菌劑的敏感性也不同[3,12]，本試驗(yàn)表明，不同抑菌抗生素對農(nóng)桿菌EHA105(pCHS)的抑菌效果不同，羧芐青霉素對該工程菌抑菌作用較差，而頭孢霉素、頭孢曲松鈉、特美汀的抑菌作用較強(qiáng)。 植物遺傳轉(zhuǎn)化的選擇培養(yǎng)過程中，若抑菌抗生素濃度過低，則起不到良好的抑菌效果；濃度過高，雖然可以抑菌，但對植物會(huì)產(chǎn)生毒害作用，從而抑制葉片愈傷的形成[24]。因此，在加入抗生素抑制農(nóng)桿菌生長的同時(shí)，必須保證所加抗生素不影響葉片愈傷組織的形成。在明確了對EHA105(pCHS)的最適抑菌劑后，必須結(jié)合抑菌劑對紫雨樺葉片愈傷形成的影響，最后確定適宜的抑菌劑及其濃度，結(jié)果表明：特美汀對紫雨樺的愈傷形成影響最小，在濃度800 mg/L條件下，紫雨樺的愈傷形成率仍為70%；頭孢霉素的影響次之，在800 mg/L時(shí)，愈傷形成率為55.6%；頭孢曲松鈉在600 mg/L，愈傷形成率僅為30%。因此，在紫雨樺的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，適宜的抑菌抗生素有3種，即頭孢霉素、頭孢曲松鈉、特美汀，其中頭孢霉素和頭孢曲松鈉的適宜濃度范圍為200～400 mg/L，特美汀為400 ～800 mg/L。然而，長期使用同一種抗生素，細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生耐藥性而起不到抑菌作用[25]，因此，若開展紫雨樺的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，建議交替使用頭孢霉素、頭孢曲松鈉、特美汀3種抗生素。

植物轉(zhuǎn)基因研究中，常利用選擇抗生素來篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，不同載體所含有的選擇標(biāo)記基因不同，需要的選擇抗生素也不同。本研究所用載體包括NPTII和HPT等2種選擇標(biāo)記基因，其中，NPTII編碼合成新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT)，能分解卡那霉素、G418、新霉素等氨基糖苷類抗生素，使其磷酸化而失活；HPT編碼合成潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)，該酶可分解潮霉素。含有這些選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物對相應(yīng)的抗生素具有抗性[26]。合適的選擇抗生素濃度也是轉(zhuǎn)基因成功的關(guān)鍵，濃度過低，起不到篩選作用，濃度過高又可能使轉(zhuǎn)化細(xì)胞因生長能力變?nèi)醵劳鯷27]。因此，確定適宜的選擇抗生素種類和濃度對獲得成功的轉(zhuǎn)化子是非常必要的。同時(shí)外植體不同，即使是同一樹種，由于品種的不同，所需要的抑菌抗生素和選擇抗生素的種類和濃度可能也不盡相同[17-18,22]。如卡那霉素和新霉素可作為山新楊(Populusdavidiana×P.bollena)遺傳轉(zhuǎn)化中的較好選擇劑，適宜濃度分別為20 mg/L和50 mg/L[17]，而銀白楊(Populusalba)適宜的選擇劑是15 mg/L卡那霉素和10 mg/L的G418[28]。我國白樺遺傳轉(zhuǎn)化研究始于2003年[3]，主要用卡那霉素作為選擇抗生素，其使用濃度在15～50 mg/L[3,7,12]，可見同是白樺(Betulaplatyphylla)，不同個(gè)體之間對抗生素濃度的要求也存在差異。以紫雨樺離體葉片為試材的選擇抗生素篩選試驗(yàn)結(jié)果表明：卡那霉素要求的濃度為30～40 mg/L，G418或潮霉素的濃度為15～20 mg/L，新霉素不是適宜的選擇劑。紫雨樺是歐洲白樺的一個(gè)變種，與白樺不同的是葉片為紫色，葉片中花色素苷含量顯著高于歐洲白樺[15]。目前認(rèn)為，這些代謝物含量的改變致使遺傳轉(zhuǎn)化中選擇劑的濃度不同于白樺[3,7,12]。因此，在開展紫雨樺遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)之前，抗生素敏感性試驗(yàn)的探究是非常必要的，本試驗(yàn)結(jié)果為紫雨樺遺傳轉(zhuǎn)化研究提供了參考依據(jù)。

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