吳岐奎 邢世巖 范圣明 王 萱 孫立民 劉曉靜

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東 泰安 271018；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)科技信息研究所，北京 100091)

銀杏(GinkgobilobaL.)是銀杏類植物經(jīng)歷第四紀(jì)冰川浩劫后孑遺下來的為數(shù)不多的物種之一，素有“活化石”的美稱，是世界上現(xiàn)存最古老的高等植物。銀杏原產(chǎn)中國，據(jù)文獻(xiàn)記載三國時盛植江南，唐代已產(chǎn)于中原，宋朝更為普遍[1]。有關(guān)垂乳銀杏的研究在中國、日本均有所報道，美國、歐洲等尚未有明確的報道[2]。北京大學(xué)李正理教授稱銀杏垂乳為“類鐘乳枝或鐘乳枝(stalactite-like branches)”，“鐘乳”(“zhong-ru”)，意思是鐘乳石；江蘇農(nóng)學(xué)院何鳳仁教授稱之為“樹奶”，銀杏產(chǎn)區(qū)的群眾稱為“樹瘤”、“撩子或撩”。銀杏根部垂乳稱“根鐘乳”( 又名根奶、椅子根、根臺)，我國四川、重慶一帶稱“乳包”。 在日本稱“垂乳”為“chichi”(nipple or breast) ，意思是乳頭狀凸起、奶子或樹奶[3]。垂乳銀杏主要分布在我國部分省市地區(qū)以及日本境內(nèi)，以我國西南地區(qū)為主要分布地區(qū)。AFLP標(biāo)記是目前較為常用的分子標(biāo)記方法，具有方便快捷，只需極少的DNA材料，不需要預(yù)先知道基因組序列信息，多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)勢，是檢測種質(zhì)遺傳多樣性和進(jìn)行種質(zhì)親緣關(guān)系分析的有效工具[4-6]。

我國對垂乳銀杏種質(zhì)的研究主要集中在其個體發(fā)育及生物學(xué)意義上，在分子水平上對垂乳銀杏的研究尚未有報道[7]。本研究采集我國云南、四川以及日本的優(yōu)良垂乳銀杏種質(zhì)，使用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對其進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，為垂乳銀杏種質(zhì)資源的評價、保存、利用提供一定的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2012年5月，在山東泰安市藥鄉(xiāng)林場銀杏種質(zhì)資源苗圃中，采集14個垂乳銀杏種質(zhì)嫁接苗(表1)的幼嫩葉片，放入自封袋中，再加入10倍質(zhì)量的變色硅膠用于干燥，干燥過程中翻動2～3次，硅膠變色時及時更換，以保證葉片在12 h之內(nèi)完全干燥，用于DNA的提取。

表1 垂乳銀杏試驗材料編號及來源

1.2 試驗方法

1.2.1DNA的提取 稱取垂乳銀杏嫩葉約50 mg，垂乳銀杏總DNA的提取參照Doyle等的方法[8]，采用CTAB法提取幼嫩葉片總DNA。

1.2.2AFLP體系的建立 酶切與連接反應(yīng)同時進(jìn)行，內(nèi)切酶為PstI和MseI，加入4 μL模板DNA(50 ng/μL)、1 μL Adapter(10 mmol/L)、2 μLPstI/MseI(10 U/μL)、2.5 μL 10×Reaction buffer、2.5 μL ATP(10 mmol/L)、1 μL T4 Ligase(5 U/μL)等構(gòu)成20 μL酶切連接反應(yīng)體系。將反應(yīng)體系置于0.5 mL離心管中，混勻離心數(shù)秒，37 ℃保溫5 h，8 ℃保溫4 h，4 ℃過夜。

選擇PstI(5’- GAC TGC GTA CAT GCA G- 3’)和MseI(5’- GAT GAG TCC TGA GTA A C- 3’)為預(yù)擴增引物。取2 μL酶切連接后的產(chǎn)物為模板，加入1 μL預(yù)擴增引物(10 μmol/L)、0.5 μL dNTPs(10 mmol/L)、2.5 μL 10×PCR buffer、0.5 μLTaqDNA聚合酶(2 U/μL)等構(gòu)成25 μL預(yù)擴增體系。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性2 min； 94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

以預(yù)擴產(chǎn)物稀釋20倍后作為選擴增模板，加入1 μLPstI引物(10 μmol/l)、1 μLMseI引物(10 μmol/L)、2.5 μL 10×PCR buffer、0.5 μL dNTPs(10 mmol/L)、0.5 μL的Taq酶(2 U/μL)等構(gòu)成25 μL的選擴增體系。PCR程序為：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s進(jìn)行第1輪擴增，以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7 ℃，共擴增12輪，接著94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s擴增23輪，然后72 ℃延伸5 min。選擴增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，獲得的電泳圖譜用ABI377 PRISM 377 sequencer測序儀(美國ABI公司)檢測片段大小。

1.3 數(shù)據(jù)分析

電泳圖譜經(jīng)ABI377 PRISM377 sequencer測序儀檢測片段大小，對遷移率相同的條帶進(jìn)行統(tǒng)計，經(jīng)GENESCAN軟件分析，得到原始數(shù)據(jù)，將原始數(shù)據(jù)中有帶的換成“1”，無帶的換成“0”，構(gòu)建“01矩陣”，以供下一步分析。利用POPGENE version 1.31軟件計算遺傳多樣性指標(biāo)：多態(tài)性比例(PPB)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)。采用NTSYSpc version 2.10e軟件計算各單株間的遺傳相似性系數(shù)(SC)，并進(jìn)行UPGMA聚類分析和主坐標(biāo)分析以了解14個垂乳銀杏種質(zhì)間的遺傳關(guān)系[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 垂乳銀杏AFLP選擇性擴增結(jié)果及多態(tài)性分析

引物組合P-GAA/M-CTG對垂乳銀杏AFLP的選擇性擴增結(jié)果見圖1。

從64對引物組合中選出8對多態(tài)性較好的引物組合用于垂乳銀杏AFLP的選擇性擴增，由圖1可知，圖譜顯示擴增多態(tài)性好，信號強度高，易于分辨，適合進(jìn)行垂乳銀杏遺傳多樣性統(tǒng)計分析。

用篩選出的8對引物進(jìn)行選擇性擴增，共產(chǎn)生935條譜帶(表2)，平均每對引物擴增產(chǎn)生117.88條譜帶，其中多態(tài)帶為920條，平均多態(tài)帶比例為98.40%，不同引物的多態(tài)帶比例為97.00%～100.00%。不同引物產(chǎn)生的譜帶數(shù)量存在一定的差異，其中P-GAA/M-CTG引物產(chǎn)生的譜帶最多(153條)，而P-GAC/M-CTA引物產(chǎn)生的譜帶最少(91條)。每對引物的鑒別效率為100%，由此可見：所選擇的引物在垂乳銀杏間表現(xiàn)出較高的多態(tài)性水平，說明AFLP是一種十分有效地分析垂乳銀杏遺傳多樣性的方法。

表2 AFLP選擇性擴增引物產(chǎn)生的條帶多態(tài)性

運用POPGENE version 1.31軟件對各位點觀測的Na、Ne、H、I進(jìn)行統(tǒng)計分析(表3)。14份垂乳銀杏種質(zhì)觀測等位基因數(shù)(Na)平均值為 1.981 6，有效等位基因數(shù)(Ne)平均值為 1.457 9，Nei’s基因多樣性(H)平均值為 0.276 5，Shannon信息指數(shù)(I)平均值為 0.429 3。由此可見，8對引物在所分析的垂乳銀杏資源中多態(tài)性好，垂乳銀杏的遺傳多樣性處于一個較高的水平。

表3 基于不同引物組合的垂乳銀杏遺傳多樣性水平

2.2 垂乳銀杏種質(zhì)資源的特異性位點分析

不同引物組合下垂乳銀杏無性系特異性位點分析結(jié)果見表4。

表4 基于不同引物組合的垂乳銀杏種質(zhì)資源的特異位點

分析8對引物對14份垂乳銀杏種質(zhì)資源的電泳條帶，產(chǎn)生210條特異性條帶(包括單態(tài)帶和缺失帶)，其中缺失帶34條，占特異性總條帶的16.19%。不同的垂乳銀杏產(chǎn)生的特異性條帶不同，C3產(chǎn)生的特異性條帶最多，達(dá)到了47條，其中包括7條缺失帶；其次是C7，達(dá)到了22條，其中包括4條缺失帶。不同的引物組合產(chǎn)生的特異性條帶也不相同，產(chǎn)生特異性條帶最多的是P-GAA/M-CTG，共產(chǎn)生44條特異性條帶，其中有3條缺失帶；產(chǎn)生特異性條帶最少的是P-GAC/M-CAC，共產(chǎn)生12條特異性條帶，其中有3條缺失帶。

2.3 垂乳銀杏種質(zhì)資源間的遺傳關(guān)系分析

不同種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)為 0.440 4～0.729 9，平均值為 0.475 2。C1與C2的遺傳相似系數(shù)最大(0.729 9)，說明二者的親緣關(guān)系最相近，遺傳差異性最小。C7與C12的遺傳相似系數(shù)最小(0.440 4)，說明二者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，差異性最大。C2與其他垂乳銀杏種質(zhì)的相似性系數(shù)平均值最大(0.638 6)；C10與其他垂乳銀杏種質(zhì)的相似性系數(shù)平均值最小(0.506 0)，說明C10與其他種質(zhì)相似性低，親緣關(guān)系遠(yuǎn)。

將14個垂乳銀杏種質(zhì)進(jìn)行UPGMA聚類(圖2)，在相似系數(shù)0.51處，供試材料分為2大類：I類包括13個種質(zhì)；II類包括1個種質(zhì)，即C10。在相似系數(shù)0.60處，可將垂乳銀杏分為5類：第1類包括4個種質(zhì)，即C1、C2、C9、C13；第2類包括6個種質(zhì)，即C3、C4、C5、C6、C7、C8；第3類包括2個種質(zhì)，即C11、C14；第4類包括1個種質(zhì)，即C12；第5類包括1個種質(zhì)，即C10。

基于DICE遺傳相似矩陣(GS)，通過主坐標(biāo)分析構(gòu)建垂乳銀杏種質(zhì)資源的三維分布圖，以進(jìn)一步了解種質(zhì)間的遺傳關(guān)系(圖3)。結(jié)果顯示：第1主分量特征值為 0.941 4，貢獻(xiàn)率16.40%；第2主分量特征值為 0.567 3，貢獻(xiàn)率為9.88%；第3主分量特征值為 0.532 3，貢獻(xiàn)率為9.27%，前3個主分量累計貢獻(xiàn)率達(dá)到35.55%。從圖3可以看出，來自云南騰沖的垂乳銀杏種質(zhì)較為聚攏，來自四川萬源的垂乳銀杏種質(zhì)較為分散；其中C10種質(zhì)與其他種質(zhì)關(guān)系較遠(yuǎn)。主坐標(biāo)分析結(jié)果與UPGMA聚類分析結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論與討論

8對引物共檢測到935條譜帶，其中有920條多態(tài)帶，平均多態(tài)帶比例為98.40%，平均每對引物產(chǎn)生115條多態(tài)帶。8對引物共產(chǎn)生210條特異性條帶，包括34條缺失帶。14份垂乳銀杏種質(zhì)Nei’s基因多樣性(H)平均值為 1.981 6，Shannon信息指數(shù)(I)平均值為 0.429 3。在相似系數(shù)0.60處，可將垂乳銀杏分為5類。來自同一地區(qū)的垂乳銀杏并沒有完全聚在一起，說明垂乳銀杏間的親緣關(guān)系沒有嚴(yán)格的相關(guān)性。

AFLP采用的限制性內(nèi)切酶及選擇性堿基的種類、數(shù)目有很多，因此理論上能產(chǎn)生的標(biāo)記數(shù)目是無限的，能比較全面地揭示不同物種或種質(zhì)資源的遺傳特征，非常適用于親緣關(guān)系較近材料的研究。AFLP能夠穩(wěn)定、高效地擴增垂乳銀杏種質(zhì)基因組DNA，是研究垂乳銀杏種質(zhì)遺傳多樣性的有效方法。

王利等研究了29個銀杏雄株種質(zhì)和21個觀賞品種之間的遺傳關(guān)系[11-13]，遺傳多樣性反映了一個物種的環(huán)境適應(yīng)力、生存能力、進(jìn)化潛力及被改造和利用的空間。21個銀杏觀賞品種的多態(tài)帶比例為88%；各品種間的相似系數(shù)為0.45～0.85，表明它們存在不同程度的遺傳差異。本研究中14種垂乳銀杏多態(tài)帶比例為98.40%，高于21個觀賞銀杏品種的多態(tài)性，表明它們遺傳差異大，遺傳多樣性豐富。

通過UPGMA聚類分析和主坐標(biāo)分析，來自云南的種質(zhì)遺傳關(guān)系較為聚攏，來自四川的種質(zhì)遺傳關(guān)系較為分散，來自日本的種質(zhì)并無明顯的特異性，這與Y.Tsumura等的研究相一致，中國與日本銀杏親緣關(guān)系近，這與公元6世紀(jì)銀杏從中國傳至日本有關(guān)[14]。

S. K. Singh等采用AFLP技術(shù)對印度西南地區(qū)的20株銀杏進(jìn)行分析，表明地理來源與遺傳距離之間沒有確定的關(guān)系[15]。本研究中，來源相同的垂乳銀杏種質(zhì)并沒有嚴(yán)格的聚集到一起，說明其變異與地理來源無嚴(yán)格的相關(guān)性，這與王利等的研究結(jié)果基本一致。由此可見，在垂乳銀杏育種和研究利用過程中，不僅要考慮材料地理來源的差異，更要考慮材料間遺傳差異的大小。

要全面了解垂乳銀杏的遺傳多樣性，還需進(jìn)一步的研究，結(jié)合其他的DNA分子標(biāo)記技術(shù)在更大種質(zhì)范圍內(nèi)，從多角度、多層面研究垂乳銀杏的遺傳多樣性，為垂乳銀杏種質(zhì)的保護(hù)、利用、引種提供理論支持。另外，對垂乳銀杏種質(zhì)的取材不夠全面、數(shù)量偏低是本研究的一大缺憾，在以后的研究中要有必要適當(dāng)擴大取材范圍。

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