蔡 樂，白 林，徐風(fēng)華，任 韡，王歡歡（解放軍總醫(yī)院藥品保障中心，北京 100853）

薄荷苯酚軟膏為《中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》（2002年版）中收載的皮膚科外用制劑，由苯酚、薄荷腦、凡士林和羊毛脂組成，具有止癢、消毒的作用，臨床中可用于瘙癢性皮膚病、銀屑病、神經(jīng)性皮炎等疾病。苯酚是薄荷苯酚軟膏中的主要成分，《中國藥典》（2010年版）中苯酚原料藥的含量測定方法為溴量法[1]，《中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》（2002年版）中該制劑苯酚含量測定方法為紫外分光光度法[2]。因軟膏基質(zhì)的影響，用上述方法測定時，操作繁瑣，測定結(jié)果易受提取等因素的干擾。為更好地控制該制劑的質(zhì)量，本研究對薄荷苯酚軟膏中苯酚的測定方法進(jìn)行改進(jìn)，建立HPLC法測定薄荷苯酚軟膏中苯酚的含量。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（包括1200系列在線脫氣機(jī)、四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD檢測器、色譜工作站，美國Agilent公司）；AG-285型電子天平（瑞士Mettler公司）；KQ-2200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

薄荷苯酚軟膏（本院自制，批號20130515-1、20130515-2、20130515-3）；苯酚（重慶西南制藥二廠有限責(zé)任公司，批號1209004）；甲醇為色譜純；乙醇為分析純；水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（60∶40）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：271 nm；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取苯酚約9.0 g，精密稱定，置于200 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含苯酚45 mg的儲備液A。精密移取2 mL儲備液A置于100 mL量瓶中，加流動相定容，搖勻，制成每1 mL含苯酚900 μg的儲備液B。精密移取1 mL儲備液B置于25 mL量瓶中，加流動相制成每1 mL含苯酚為36 μg的對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取供試品約0.5 g（含苯酚約5 mg），精密稱定，用80 ℃的無水乙醇將其軟化并轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加無水乙醇適量，于60 ℃下超聲15 min（功率660 W，頻率28 kHz），放至室溫用無水乙醇稀釋至刻度，揺勻，置于冰浴中冷卻2 h，取出后迅速濾過，放至室溫，取續(xù)濾液10 mL置25 mL 量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 另按處方比例及制備工藝，配制不含苯酚的空白制劑，依供試品溶液制備方法提取制備，作為陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實驗

分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液按“2.1”項下色譜條件，各進(jìn)樣10 μL，考察供試品中苯酚和其他組分色譜峰分離情況。在此色譜條件下，苯酚的保留時間為4.8 min，苯酚色譜峰峰形對稱尖銳，基線平穩(wěn)，與其他色譜峰分離良好，陰性對照在相應(yīng)位置上無干擾峰。具體見圖1。

圖1 薄荷苯酚軟膏的HPLC色譜圖A-對照品，B-供試品，C-陰性對照；1-苯酚Fig 1 HPLC chromatograms of menthol-phenol ointmentA-reference substance, B-sample, C-negative reference substance;1-phenol

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取適量儲備液B，加流動相配制成含苯酚濃度為9、18、36、72、180、360 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得苯酚的回歸方程為Y=9.266X+ 5.983，r= 0.999 9。結(jié)果表明，苯酚在9 ～360 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實驗

取“2.2.1”項下對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測定，計算苯酚的峰面積RSD（n= 6）為0.70%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗

取同一供試品（批號20130515-1）約0.5 g，共6份，精密稱定，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算含量RSD（n= 6）為0.33%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、1、3、6、9、12 h進(jìn)樣10 μL測定，計算苯酚的峰面積RSD為0.33%（n= 6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率實驗

取6份已知苯酚含量的薄荷苯酚軟膏（批號20130515-3），每份約0.5 g，精密稱定，每份分別精密加入含苯酚濃度為900 μg·mL-1的溶液5 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定苯酚的含量，并計算加樣回收率。苯酚的平均回收率為100.2%，RSD為0.68%，詳見表1。

表1 加樣回收率實驗.n = 6Tab 1 Results of recovery test.n = 6

2.9 樣品含量測定

取3批樣品（批號20130515-1、20130515-2、20130515-3），每批3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，以外標(biāo)法計算各個樣品中苯酚的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 苯酚含量測定方法的選擇

苯酚的含量測定方法主要有溴量法[1]、紫外分光光度法[2-4]、毛細(xì)管氣相色譜法[5]以及高效液相色譜法[6-8]等。由于薄荷苯酚軟膏處方中羊毛脂和薄荷腦對于溴量法測定苯酚有干擾[3]；凡士林和羊毛脂在271 nm波長下有吸收，直接采用紫外分光光度法測定苯酚會造成干擾。因此，《解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》（2002年版）其含量測定時將本品經(jīng)石油醚溶解后，在氫氧化鈉溶液中多次萃取，將苯酚堿化為苯酚鈉后進(jìn)行測定，操作繁瑣、費(fèi)時，且易因乳化而造成損失，影響結(jié)果的重現(xiàn)性。毛細(xì)管氣相色譜法對儀器要求較高，而采用HPLC法則可避免基質(zhì)對測定的干擾，專屬性強(qiáng)，且儀器較為普及，適用于醫(yī)療單位對該制劑的質(zhì)量控制。但由于軟膏基質(zhì)凡士林和羊毛脂黏度大，成分復(fù)雜，樣品處理不當(dāng)易造成色譜柱堵塞損壞色譜柱。為此，本研究在參考文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，對提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。

表2 薄荷苯酚軟膏中苯酚的含量.n = 3Tab 2 Contents determination of phenol in menthol-phenol ointment.n = 3

3.2 樣品處理方法的優(yōu)化

通過對樣品的提取溶劑進(jìn)行考察，本研究發(fā)現(xiàn)無水乙醇的提取率明顯高于流動相，但使用無水乙醇提取后，提取液用流動相稀釋會析出白色沉淀，直接進(jìn)樣易損壞色譜柱。因此，本研究在樣品提取后，利用冰浴使輔料沉淀，濾過后加入流動相稀釋，再用0.22 μm微孔濾膜濾過后進(jìn)樣，以減小供試品對色譜柱的損害[7-10]。實驗發(fā)現(xiàn)，60 ℃水浴時充分振搖可完全提取樣品，由于60 ℃超聲提取方法相對簡便且重現(xiàn)性更好，故采用60 ℃超聲處理作為本實驗的提取方法。

常溫時薄荷苯酚軟膏黏度大，精密取樣后，較難轉(zhuǎn)移至容量瓶中，易造成樣品損失。經(jīng)實驗，80 ℃的無水乙醇可將基質(zhì)軟化，提高基質(zhì)流動性，可使樣品完全轉(zhuǎn)移。綜上，結(jié)果表明本方法操作簡便、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，可作為薄荷苯酚軟膏中苯酚含量測定的方法。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：443.

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