陸 燕，潘 旭（北京積水潭醫(yī)院中藥房，北京 100035）

三七總皂苷中代表性皂苷含量測(cè)定方法學(xué)的建立及穩(wěn)定性研究

陸 燕，潘 旭（北京積水潭醫(yī)院中藥房，北京 100035）

目的：建立同時(shí)測(cè)定三七總皂苷中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1三種成分的含量測(cè)定方法，并對(duì)其各種狀態(tài)下的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。方法：以乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，采用高效液相-梯度洗脫法，同時(shí)測(cè)定三七總皂苷中三種成分的含量，并考察方法的專屬性、線性、精密度和回收率；測(cè)定四種pH值溶液中三種皂苷成分的穩(wěn)定性以及在高溫、高濕和強(qiáng)光照射條件下，三七總皂苷粉末中三種皂苷成分的穩(wěn)定性。結(jié)果：方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，在選定的梯度洗脫條件下，方法專屬性良好，三種皂苷可有效分離和定量；在各自的線性范圍內(nèi)線性良好；精密度RSD值均小于2%；三種皂苷的平均回收率分別為（98.98 ± 0.60）%、（98.86 ± 0.34）%和（100.19 ± 0.64）%，方法準(zhǔn)確性良好。穩(wěn)定性研究結(jié)果顯示，在溶液狀態(tài)下，三種皂苷的穩(wěn)定性趨勢(shì)基本一致，穩(wěn)定性與pH值密切相關(guān)，在pH 1.2溶液中藥物迅速降解，24 h含量即降低了約80%；而在pH 4.5溶液、pH 6.8溶液以及水中，三種成分的穩(wěn)定性均良好，24 h內(nèi)含量未發(fā)生明顯變化；而在三七總皂苷粉末中，三種代表性皂苷對(duì)濕、熱和光照均不敏感，10 d內(nèi)含量基本保持穩(wěn)定；但是在高濕條件下，粉末有一定的吸濕性。結(jié)論：所建立的液相方法準(zhǔn)確、可靠，溶液狀態(tài)下三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的穩(wěn)定性與pH密切相關(guān)，隨pH的降低穩(wěn)定性變差，而在固體狀態(tài)下則穩(wěn)定性良好。

三七皂苷R1；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1；穩(wěn)定性；梯度洗脫

三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）是中藥三七的主要有效成分，在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等多方面具有良好的藥理作用，臨床應(yīng)用廣泛，具有良好的新藥開發(fā)價(jià)值[1-4]。其中，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1是公認(rèn)的代表性成分，有文獻(xiàn)[5-7]報(bào)道其單用或合用具有較好的抗老年癡呆作用。結(jié)合該病癥的用藥特點(diǎn)，我們擬將之作為組方的主要成分，嘗試開發(fā)緩釋微丸，以期減少給藥次數(shù)，提高用藥順應(yīng)性。本文將以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1作為代表性成分，對(duì)三七總皂苷在各種條件下的穩(wěn)定性情況進(jìn)行全面的研究，以便于對(duì)進(jìn)一步的制劑開發(fā)和制劑工藝的選擇提供參考。關(guān)于三七總皂苷的含量測(cè)定，目前有多種條件，主流方法均為液相色譜法，但由于流動(dòng)相組成和梯度的不同，出峰時(shí)間上存在較大的差異。我們?cè)凇吨袊幍洹贩椒ǖ幕A(chǔ)上，調(diào)整了流動(dòng)相梯度，在保證良好分離的前提下，使各皂苷出峰時(shí)間明顯提前，提高了工作效率，在本研究中也對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（包括四元泵、VWD檢測(cè)器，美國Agilent公司）；BP125D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（北京陸?？萍加邢薰荆?；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；GXZ智能型光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）。

三七皂苷R1（中國藥品生物制品檢定所，純度95.9%，批號(hào)110745-200617)；人參皂苷Rg1（中國藥品生物制品檢定所，純度96.3%，批號(hào)110703-201027）；人參皂苷Rb1對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，純度92.6%，批號(hào)110704-200921）；三七總皂苷（云南金泰得三七產(chǎn)業(yè)股份有限公司，批號(hào)20080402）；乙腈為色譜純（Fisher公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；濃鹽酸、濃硫酸、無水乙酸鈉、氫氧化鈉（北京化學(xué)試劑有限公司）；冰醋酸、磷酸二氫鉀（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；甲醇等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，0 ～ 6 min A相比例為20%，25 min時(shí)A相比例變?yōu)?0%，而30 min時(shí)則回到20%，并保持此比例5 min；流速:1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長:203 nm；進(jìn)樣量: 20 μL；柱溫:30 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對(duì)照品各約10 mg，分別置3個(gè)10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，作為儲(chǔ)備液，冷藏保存。精密量取各儲(chǔ)備液1 mL，分別至10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度均約為100 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

分別取上述3種儲(chǔ)備液一定體積，至同一容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.2 供試品溶液取一定量三七總皂苷樣品，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入甲醇，超聲處理使溶解，稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn)主要目的是考察在選定的液相條件下，各種對(duì)照品、溶媒等的出峰是否存在相互干擾。取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液以及溶媒（甲醇）依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1所示。

圖1 三七總皂苷典型色譜圖A – 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，B – 溶劑（甲醇）；1 – 三七皂苷R1，2 – 人參皂苷Rg1，3 – 人參皂苷Rb1Fig 1 Typical chromatograms of Panax notoginseng saponins (PNS)A – mixed standard solution, B – solvent (methanol); 1 –notoginsenoside R1, 2 – ginsenoside Rg1, 3 – ginsenoside Rb1

由圖1可知，由于所選波長為未端吸收，甲醇中存在一定的雜質(zhì)峰，但是在選定的液相條件下，三種皂苷的出峰時(shí)間分別約為16、17、25 min，可以有效檢出和分離，沒有相互干擾，表明方法專屬性良好。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍分別取配制好的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，甲醇稀釋制成濃度分別約為1、2、5、10、20、50、100、200、400 μg·mL-1的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積（A）對(duì)濃度（C）作圖，進(jìn)行線性回歸，考察方法的線性。結(jié)果如下:三七皂苷R1標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為:A = 6.05 C + 38.21，r = 0.999 8，線性范圍為1.014 ～ 101.400 μg·mL-1。人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為:A = 6.01 C + 21.29，r = 0.999 8，線性范圍為1.001 ～ 400.223 μg·mL-1。人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為:A = 4.68 C + 15.80，r = 0.999 8，線性范圍為0.962 ～ 384.875 μg·mL-1。

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn)取“2.3.2”中濃度約為20 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD，考察方法的精密度。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的RSD值分別為0.50%、0.77%、0.49%，均小于2%，方法精密度良好，詳見表1。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果. n = 6Tab 1 Results of the precision test. n = 6

2.3.4 加樣回收率精密量取已知濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.4、0.5、0.6 mL，分別置EP管中，氮?dú)獯蹈扇軇?，每濃度下平行操?份。精密量取三七總皂苷供試品溶液1 mL，分別加入上述9個(gè)EP管中，渦旋、超聲使完全溶解后，進(jìn)樣測(cè)定，方法回收率良好，詳見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果. n = 3Tab 2 Results of the recovery test. n = 3

2.3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取“2.3.2”中濃度約為20 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置液相色譜進(jìn)樣器中，于室溫下放置，分別于第0、2、4、6 h進(jìn)樣測(cè)定。記錄各皂苷峰面積，并計(jì)算RSD值，考察在室溫進(jìn)樣的條件下工作液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，樣品溶液室溫放置8 h內(nèi)，各皂苷含量基本保持穩(wěn)定，可以滿足自動(dòng)進(jìn)樣器的要求，詳見表3。

表3 工作液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of the stability of working solutions

2.4 三七總皂苷穩(wěn)定性研究

2.4.1 不同pH值溶液中各皂苷穩(wěn)定性研究精密稱取三七總皂苷約20 mg，置于25 mL容量瓶中，加入鹽酸溶液（pH = 1.2）使溶解，并定容至刻度，于室溫下放置，分別于第0、2、4、8、12、24 h取樣測(cè)定，記錄各主峰的峰面積，考察在此溶液中各皂苷的穩(wěn)定性。其他三種介質(zhì)醋酸鹽緩沖液（pH = 4.5）、磷酸鹽緩沖液（pH = 6.8）和水同上操作。

結(jié)果顯示，溶液狀態(tài)下，皂苷的穩(wěn)定性與pH值密切相關(guān)。在pH 1.2溶液中藥物迅速降解，非常不穩(wěn)定；而在實(shí)驗(yàn)的其他幾種介質(zhì)中，三種皂苷穩(wěn)定性良好，提示在三七總皂苷制劑研究過程中應(yīng)注意避免低pH值溶媒。詳見表4。

2.4.2 固體狀態(tài)下藥物穩(wěn)定性研究通過影響因素實(shí)驗(yàn)，考察固體粉末狀態(tài)下三七總皂苷的穩(wěn)定性。分別設(shè)置高溫（60 ℃）、高濕[25 ℃，相對(duì)濕度（90 ± 5）%]和強(qiáng)光照射（4500 ± 500）Lx組，于第0、5、10天取樣測(cè)定，以吸濕增重以及總皂苷含量（三種代表性皂苷含量之和）作為指標(biāo)。結(jié)果顯示，在高濕條件下，三七總皂苷粉末略有吸濕，但3種條件下總皂苷的含量均基本保持不變，穩(wěn)定性良好。提示本品在固體粉末狀態(tài)下比較穩(wěn)定，在制劑過程中無需特殊的實(shí)驗(yàn)條件。詳見表5。

表4 不同pH值溶液中三七總皂苷各成分穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of the stability about PNS in different pH solutions

表5 三七總皂苷影響因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Results of the stability about PNS in stress factors test

3 討論

3.1 三七總皂苷指標(biāo)性成分

PNS是中藥三七的活性部位，據(jù)報(bào)道其中含有的各種皂苷類成分超過11種，但其中藥理活性的研究多集中于含量較高的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1三種成分。所以在本研究中，著重以這三種成分的穩(wěn)定性作為PNS穩(wěn)定性的指標(biāo)，作為制劑研究的參考。在將來的體內(nèi)研究中，將考慮采用LC-MS/ MS對(duì)多種皂苷成分進(jìn)行測(cè)定研究，以利于更為全面地反映制劑質(zhì)量和體內(nèi)過程。

3.2 穩(wěn)定性研究

在化藥制劑研究中，穩(wěn)定性研究作為制劑處方前研究的一個(gè)重要內(nèi)容，近年來越來越受到人們的重視。但在傳統(tǒng)中藥制劑的研究中，對(duì)于整個(gè)制劑流程中某成分的含量變化或穩(wěn)定性并沒有進(jìn)行特別的關(guān)注。從提取濃縮到分離純化，從提取物粉碎到制劑成型，有很多環(huán)節(jié)涉及到熱、濕或光照等因素，甚至是不同的酸堿性環(huán)境等，提取物中某些關(guān)鍵成分在此過程中可能會(huì)被破壞、降解，影響產(chǎn)品的質(zhì)量。在PNS的制劑研究中，我們首先進(jìn)行了不同條件下三種皂苷成分的穩(wěn)定性研究，以期了解其穩(wěn)定性情況，為制劑工藝的選擇提供參考。結(jié)果顯示，在酸性介質(zhì)中，三種皂苷穩(wěn)定性差，降解迅速，所以在制劑過程中應(yīng)避免采用酸性輔料和酸性溶媒。

[1]Qin F, Ye YP, Sun HX. Haemolytic activity and adjuvant effect of notoginsenoside K from the roots of Panax notoginseng[J]. Chem Biodivers, 2006, 3(10): 1144-1152.

[2]蒲清榮，稅丕先.三七藥理作用研究概述[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23（24）:3704-3705.

[3]鐘振國，吳登攀，王進(jìn)聲，等.三七總皂苷對(duì)快速老化小鼠SAMP8大腦β-淀粉樣蛋白前體蛋白表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19（11）:2628-2630.

[4]盧忠朋，王乃平，鐘振國.三七總皂苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的NG108-15細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22（5）:872-873，878.

[5]鮑建材，劉剛，叢登立，等.三七的化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中成藥，2006，28（2）:246-253.

[6]Zhang HS, Wang SQ. Notoginsenoside R1from Panax notoginseng inhibits TNF-alpha-induced PAI-1 production in human aortic smooth muscle cells[J]. Vascul Pharmacol, 2006, 44(4): 224-230.

[7]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[8]Ashizawa K, Uchikawa K, Hattori T, et al. Solid-state stability and preformulation study of a new parenteral cephalosporin antibiotics (E1040)[J]. Yakugaku Zasshi, 1990, 110(3): 191-201.

[9]Soares-Sobrinho JL, de La Roca Soares MF, Lopes PQ, et al. A preformulation study of a new medicine for Chagas disease treatment: physicochemical characterization, thermal stability, and compatibility of benznidazole[J]. AAPS Pharm Sci Tech, 2010, 11(3): 1391-1396.

Study on the methodology establishment of content determination and stability of representative saponins in Panax notoginseng saponins

LU Yan, PAN Xu(Dispensary of Traditional Chinese Medicine, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China)

Objective:The HPLC method for simultaneous determination of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in Panax notoginseng saponins (PNS) was established to study the stability of the saponins under different states.Methods:Acetonitrile-water system was used as the mobile phase, and the method speci fi city, linearity, precision, recovery were studied. The stability of the three saponins in different pH solutions and solid state was evaluated.Results:The results of method validation showed good speci fi city, effective separation and quanti fi cation, as well as good linearity of the three saponins in their linear range. The precision RSD values were less than 2%, average recovery rates were (98.98 ± 0.60)%, (98.86 ± 0.34)% and (100.19 ± 0.64)% for the three saponins respectively. The stability results showed that the stability of the three saponins was closely related to the pH value under the solution state, with rapid degradation about 80% in 24 h in pH 1.2 solutions and little degradation in the other test medium. In the solid powder state, the stability of saponins was good under the experimental high temperature, high humidity and highlight conditions, while a little moisture absorption was found in the high humidity conditions.Conclusion:The HPLC method was reliable. Stability of three saponins was closely related to the pH value of solution, while they were stable under solid state.

Notoginsenoside R1; Ginsenoside Rg1; Ginsenoside Rb1; Stability; Gradient elution

R917

A

1672 – 8157(2014)02 – 0088 – 04

2013-09-10

2013-11-07）

陸燕，女，主管藥師，主要從事臨床藥學(xué)工作。E-mail:caojie2002@163.com