黃曉會，劉　艷，張　?。ㄉ虾＝煌ù髮W(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海 200092）

HPLC法測定人血清中萬古霉素及去甲萬古霉素濃度及臨床應(yīng)用

黃曉會，劉艷，張?。ㄉ虾＝煌ù髮W(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海 200092）

目的：建立同時測定血清中萬古霉素及去甲萬古霉素濃度的高效液相色譜法。方法：采用Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液（pH = 3.2）（7.5∶92.5）；流速：1 mL·min-1；檢測波長：236 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：25 μL；二極管陣列檢測。內(nèi)標(biāo)法定量，萬古霉素與去甲萬古霉素互為內(nèi)標(biāo)。結(jié)果：去甲萬古霉素低、中、高3個濃度（3.125、25.000、50.000 μg·mL-1）的方法回收率分別為98.5%、102.2%、103.1%，萬古霉素低、中、高3個濃度（3.125、25.000、50.000 μg·mL-1）的方法回收率分別為96.2%、100.8%、103.5%，日內(nèi)精密度RSD小于3.24%，日間精密度RSD小于6.12%。結(jié)論：本方法準(zhǔn)確度高，靈敏度好，操作簡便，符合萬古霉素及去甲萬古霉素血藥濃度監(jiān)測和藥代動力學(xué)研究的要求。

萬古霉素；去甲萬古霉素；高效液相色譜法

萬古霉素（vancomycin）屬于三環(huán)糖肽類抗菌藥物，臨床上主要用于敏感革蘭陽性菌，特別是嚴(yán)重耐藥的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌所致心內(nèi)膜炎、骨髓炎、肺炎等感染性疾病，全球僅9株金黃色葡萄球菌耐藥，被譽(yù)為抗生素最后一道防線。其具有一定的抗生素后效應(yīng)，為時間依賴性抗菌藥物，并且具有耳、腎毒性和血栓性靜脈炎等嚴(yán)重不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用時常需進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測，并及時調(diào)整給藥方案。本實(shí)驗(yàn)參考現(xiàn)有文獻(xiàn)[1-9]報道的9種HPLC法測定血清中萬古霉素與去甲萬古霉素的方法，對比其前處理方法與色譜條件，對沉淀蛋白劑進(jìn)行優(yōu)化分析、驗(yàn)證，最終建立了一種較為精確、快速、實(shí)用的萬古霉素及去甲萬古霉素的測定方法，并應(yīng)用于本院血藥濃度監(jiān)測。

1　材料與方法

1.1儀器與試藥

1260高效液相色譜儀（包括G1367E自動進(jìn)樣器、G1311B四元泵、G4212B二極管陣列檢測器，美國Agilent公司）；Milli-Q純水器（Millipore公司）；Vortex KB3型旋渦混懸器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；5424R高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）。萬古霉素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號130329-200501）；去甲萬古霉素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號130359-200503）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；磷酸、磷酸二氫鉀、三氯醋酸、硫酸鋅均為分析純。

1.2溶液的配制

1）標(biāo)準(zhǔn)儲備液:精密稱取萬古霉素對照品和去甲萬古霉素對照品各20 mg，用水定容至5 mL的容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為4000 μg·mL-1的對照品工作液。2）磷酸二氫鉀緩沖液:精密稱取磷酸二氫鉀6.805 g，用水溶解并定容至1000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.2，配制成0.05 mol·L-1的磷酸二氫鉀緩沖液。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件色譜柱:Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相:乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液（pH = 3.2）（7.5∶92.5）；流速:1 mL·min-1；檢測波長:236 nm；進(jìn)樣量:25 μL；柱溫:30 ℃。

1.3.2樣品預(yù)處理精密取待測人血清樣品200 μL于1.5 mL Eppendorf管中，加入內(nèi)標(biāo)（萬古霉素或去甲萬古霉素）溶液200 μL（12.5 mg·mL-1），加入4%的硫酸鋅溶液100 μL，渦旋振蕩1 min，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣分析。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取血清900 μL，加入4000 μg·mL-1的萬古霉素/去甲萬物霉素標(biāo)準(zhǔn)品儲備液100 μL，配制成400 μg·mL-1的溶液，依次用空白血清稀釋成100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.562 5 μg·mL-1的血清標(biāo)本，同時稀釋得低、中、高3種濃度的質(zhì)控血清標(biāo)本，使其濃度分別為3.125、25.000、50.000 μg·mL-1。

2　結(jié)果

2.1色譜分離結(jié)果

在“1.3.1”項(xiàng)色譜條件下，萬古霉素與去甲萬古霉素分離完全，血中內(nèi)源性物質(zhì)對測定結(jié)果無干擾，見圖1。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

測定標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本，以去甲萬古霉素/萬古霉素的峰面積為縱坐標(biāo)，樣本濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示:去甲萬古霉素與萬古霉素均在1.562 5 ～100.000 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。去甲萬古霉素的線性方程為:Y = 0.099 8 X – 0.056 7，r = 0.999 8；萬古霉素的線性方程為:Y = 0.097 3X – 0.346，r = 0.996 4。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，本方法中去甲萬古霉素與萬古霉素的定量限均為1.562 5 μg·mL-1。

圖1　萬古霉素與去甲萬古霉素血清色譜圖1 –去甲萬古霉素，2 –萬古霉素Fig 1　HPLC chromatogram of vancomycin and norvancomycin in serum1 – norvancomycin; 2 – vancomycin

2.3方法回收率與精密度實(shí)驗(yàn)

分別測定低、中、高3個濃度水平的血清質(zhì)控標(biāo)本各5組，計(jì)算方法回收率和日內(nèi)精密度（RSD）；連續(xù)測定5日，計(jì)算日間精密度。日內(nèi)、日間精密度均小于7%，見表1。

表1　測定血清中萬古霉素與去甲萬古霉素的方法回收率、精密度結(jié)果. n = 5Tab 1　Results of the recovery rates and precision of vancomycin and norvancomycin in serum. n = 5

2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取低、中、高濃度各3個平行樣品，按“1.3.2”項(xiàng)下處理后，將上清液在室溫分別放置4、24、48 h后重復(fù)測定，計(jì)算變異系數(shù)（CV%）；將配置好的血清質(zhì)控標(biāo)本置于– 4 ℃冰箱分裝保存，每隔1周復(fù)測1次，3個水平分別測3組平行樣品，計(jì)算CV%。結(jié)果顯示，去甲萬古霉素和萬古霉素的血清標(biāo)本在上述情況下穩(wěn)定性良好，測定值CV% ＜ 10%。

2.5臨床應(yīng)用

采用本方法為2013年1 – 10月本院及外來的61例重癥感染患者進(jìn)行萬古霉素或去甲萬古霉素的血藥濃度監(jiān)測，其中萬古霉素57例，去甲萬古霉素4例，萬古霉素測定峰濃度共28例，谷濃度共29例，去甲萬古霉素峰谷濃度各2例。由于去甲萬古霉素監(jiān)測較少，故此只對萬古霉素監(jiān)測結(jié)果進(jìn)行分析，其中9例患者血清谷濃度低于10 μg·mL-1，17例患者谷濃度在10 ～ 20 μg·mL-1之間，只有3例大于20 μg·mL-1，根據(jù)《萬古霉素臨床應(yīng)用中國專家共識（2011版）》，萬古霉素血藥谷濃度臨床上應(yīng)控制在10 ～ 20 μg·mL-1，嚴(yán)重感染患者血藥谷濃度應(yīng)控制在15 ～ 20 μg·mL-1，至少要保持在10 μg·mL-1以上，以免發(fā)生耐藥。根據(jù)檢測結(jié)果，并結(jié)合患者實(shí)際情況，對藥物的用量做了適當(dāng)調(diào)整。血藥濃度監(jiān)測結(jié)果說明萬古霉素在患者中具有較大個體差異，對其進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測非常重要。

3　討論

3.1前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

血樣處理方法的選擇直接影響HPLC的應(yīng)用效果，萬古霉素與去甲萬古霉素血樣處理方法常用的有固相萃取法和直接沉淀法，前者較為繁瑣，后者較為簡便、省時，但有些蛋白沉淀劑并不能達(dá)到理想效果。目前，關(guān)于萬古霉素血藥濃度的HPLC測定方法國內(nèi)外均有報道[1-6]，考慮萬古霉素和去甲萬古霉素性質(zhì)等各方面的因素，初步選擇乙腈、甲醇、10%硫酸鋅、20%硫酸鋅、30%硫酸鋅、高氯酸、6%高氯酸、乙腈- 6%高氯酸（1∶6）常用沉淀提取劑進(jìn)行前處理優(yōu)化。結(jié)果顯示，單從外觀方面，乙腈、甲醇、高氯酸、6%高氯酸、乙腈- 6%高氯酸（1∶6）凈化效果較好，10%硫酸鋅、20%硫酸鋅、30%硫酸鋅常溫條件下離心后，會出現(xiàn)肉眼可見的渾濁，但是10%硫酸鋅凈化效果明顯好于20%硫酸鋅以及30%硫酸鋅，故并非硫酸鋅用量越多凈化越好。從進(jìn)樣回收率方面，乙腈的回收率幾乎為0，甲醇、高氯酸、6%高氯酸、乙腈- 6%高氯酸（1∶6）在60%左右，而用硫酸鋅凈化的回收率均在90%以上，故選用硫酸鋅做沉淀提取劑。

進(jìn)一步研究硫酸鋅與血清的比例，以達(dá)到最優(yōu)進(jìn)化效果。前處理體系為200 μL血清+ 200 μL內(nèi)標(biāo)+100 μL沉淀提取劑，故配制2%硫酸鋅、5%硫酸鋅、10%硫酸鋅進(jìn)行優(yōu)化對比，結(jié)果顯示5%的硫酸鋅凈化效果最好，回收率最高，即硫酸鋅沉淀提取劑與血清的配比應(yīng)為:每毫升血清需加入0.25 g的硫酸鋅。由于各方法的前處理體系并不相同，故需要的蛋白沉淀劑劑量也不相同，檢測者可根據(jù)所監(jiān)測的血樣，按照實(shí)際應(yīng)用換算需要加入沉淀劑的量，不局限于本體系，還適用與各種體系，使檢測者換算更方便，準(zhǔn)確。

3.2萬古霉素監(jiān)測的必要性

不恰當(dāng)?shù)目咕幬镏委煼桨覆粌H會延長患者住院時間，甚至使臨床治療喪失應(yīng)有的效果，且容易誘導(dǎo)耐藥菌的產(chǎn)生，而恰當(dāng)?shù)闹委煼桨赋诉x擇正確的抗菌藥物外，合適的劑量和給藥間隔也至關(guān)重要[7]。有文獻(xiàn)[9]報道預(yù)防用藥的不合理比例明顯高于治療用藥。本次監(jiān)測57例萬古霉素患者，單獨(dú)使用萬古霉素僅13例，聯(lián)用一種抗感染藥物21例，聯(lián)用兩種抗感染藥物16例，聯(lián)用三種抗感染藥物7例；在所有與萬古霉素聯(lián)用的抗感染藥物中，主要有美羅培南、亞胺培南、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、頭孢吡肟、利尿劑等，其中用于治療用藥為90.75%，預(yù)防用藥為9.25%，用藥相對合理。

應(yīng)根據(jù)藥代動力學(xué)個體化調(diào)整萬古霉素的劑量和實(shí)現(xiàn)目標(biāo)血藥濃度監(jiān)測。推薦通過血藥谷濃度進(jìn)行劑量調(diào)整，新生兒保持谷濃度在5 μg·mL-1以上，成人則推薦為15 ～ 20 μg·mL-1。國家衛(wèi)生部《二、三級綜合醫(yī)院藥學(xué)部門基本標(biāo)準(zhǔn)》（衛(wèi)醫(yī)政發(fā)[2010]99號）中，將血藥濃度監(jiān)測設(shè)備列為二級以上醫(yī)院藥劑科“至少應(yīng)當(dāng)配備”的基本設(shè)備之一。僅通過藥品說明書和醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)給藥，很難使血藥濃度達(dá)到目標(biāo)范圍，必須借助血藥濃度監(jiān)測來實(shí)施精細(xì)調(diào)控。綜合患者的實(shí)際情況給出用藥建議，減少不合理處方，降低不良反應(yīng)的發(fā)生。

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[2]林秀麗，朱金平，費(fèi)燕.HPLC法快速測定萬古霉素和去甲萬古霉素的血藥濃度[J].中國臨床藥學(xué)雜志，2011，20（4）:231-234.

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Concentration determination of vancomycin and norvancomycin by HPLC as well as its clinical application

HUANG Xiao-hui, LIU Yan, ZHANG Jian(Department of Pharmacy, Xinhua Hospital, Shanghai Jiao tong University School of Medicine, Shanghai 200092, China)

Objective:To establish the HPLC method for fast, effective, simultaneous determination of vancomycin and norvancomycin in serum.Methods:The extract was separated by Diamonsil C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of acetonitrile-potassium dihydrogen phosphate buffer solution (pH = 3.2) (7.5∶92.5) with the fl ow rate of 1 mL·min-1. The detection wavelength was set at 236 nm. The column temperature was 30 ℃ and the sample size was 25 μL. Vancomycin and norvancomycin were used as the internal standard for each other.Results:For norvancomycin, the average method recovery rates of three concentrations (3.125, 25.000, 50.000 μg·mL-1) were 98.5%, 102.2%, and 103.1% respectively. For vancomycin, the average method recovery rates of three concentrations (3.125, 25.000, 50.000 μg·mL-1) were 96.2%, 100.8% and 103.5% respectively. The within-day RSD was less than 3.24%, and between-day RSD was less than 6.12%.Conclusion:The method was accurate, sensitive, simple, which was suitable for the therapeutic drug monitoring (TDM) and pharmacokinetic study of vancomycin as well as norvancomycin.

Vancomycin; Norvancomycin; HPLC

R917

A

1672 – 8157(2014)02 – 0092 – 03

2013-11-11

2014-01-14）

國家自然科學(xué)基金青年基金（81202598）；上海市高校青年教師培養(yǎng)資助基金（ZZjdyx13091）

張健，男，主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事臨床藥學(xué)與臨床藥理工作。E-mail:zj_boss@126.com

黃曉會，女，藥師，主要從事臨床藥理學(xué)工作。E-mail:huangdi456@126.com