王耀晟， 程曉曙， 洪葵 ，吳宗貴， 李毅剛

人體正常核心體溫保持在36.6～37.6 ℃，暴露于極端寒冷時，體內(nèi)核心溫度穩(wěn)態(tài)被破壞[1]，刺激交感神經(jīng)，影響血管收縮，造成血壓、心率波動，誘導(dǎo)血小板活化、促進(jìn)血栓形成[2]。低溫誘導(dǎo)心肌損傷的細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)制仍不完全清楚。體外研究報(bào)告發(fā)現(xiàn)低溫刺激加速心肌細(xì)胞（CMs）凋亡[3]。凋亡的機(jī)制涉及許多方面，如線粒體膜通透性、細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）和鈣離子水平等[4]。線粒體膜電位（ΔΨm）破壞可導(dǎo)致電子傳遞鏈中斷，停止氧化磷酸化，并增加細(xì)胞內(nèi)活性氧，從而促進(jìn)細(xì)胞損傷[5]。細(xì)胞內(nèi)鈣超載，也可導(dǎo)致異常線粒體氧化磷酸化，造成細(xì)胞的不可逆的損害[6]。故此本研究探討了低溫刺激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷與線粒體途徑細(xì)胞凋亡、ROS爆發(fā)，以及細(xì)胞內(nèi)鈣超載的關(guān)聯(lián)性。凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bim是Bcl-2家族中的促凋亡成員，其在各個器官中廣泛表達(dá)[7]。在不同類型細(xì)胞中，Bim的轉(zhuǎn)錄水平、亞細(xì)胞定位和磷酸化形式各不相同[8]。目前，Bim在低溫刺激引起心肌細(xì)胞凋亡中的具體機(jī)制不明。研究發(fā)現(xiàn)Bim的上游存在調(diào)控物質(zhì)，可能與細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）傳導(dǎo)通路有關(guān)。抑制ERK可產(chǎn)生Bim的上調(diào)效應(yīng)[9]。而同屬絲裂原活化的蛋白激酶（MAPK）亞家族成員的ERK5是否參與其中，少見報(bào)道。本研究著重探討ERK5 / Bim途徑在低溫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷及凋亡中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動物與材料：2012-01至2012-12選擇新生1～2天的sprague dawley（SD）乳鼠（中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號: 中科院動管會第005號）。改良Eagle 培養(yǎng)基（ DMEM） 、胎牛血清、胰蛋白酶 （美國Gibco 公司） ，培養(yǎng)皿（ 美國Corning公司），5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU，美國Sigma 公司），脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒（美國Invitrogen公司），蛋白抽提試劑盒（武漢博士德公司）。羊抗鼠 Bim EL抗體、ERK5抗體、p-ERK5抗體（北京愛迪博公司），β-肌動蛋白（β-actin內(nèi)參照）抗體和抗山羊活化辣根過氧化物酶-IgG抗體（美國Santa Cruz 公司），化學(xué)發(fā)光試劑盒（英國Amersham公司）。膜聯(lián)蛋白V- 熒光素 /碘化丙啶（Annexin V-FITC / PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國 BD Pharmingen公司）。鈣離子熒光（Fluo-3AM）探針（北京泛博生化公司）。 6 -羧基-2', 7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（6-carboxy-H2DCFHDA）、5, 5', 6, 6'- 四氯 - 1, 1, 3, 3'- 四乙基苯并咪唑-硫雜羰花青碘化物（JC-1，美國Invitrogen公司）。

原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)：乳鼠浸泡在70%酒精內(nèi)麻醉處死。取心室組織溫浴PBS溶液洗滌后剪碎，以0.25%胰蛋白酶在37℃溫浴消化10分鐘。加入含10%胎牛血清DMEM終止消化。棄上清液后加入0.25%胰蛋白酶在37℃溫浴消化15分鐘，收集上清液。上述消化步驟重復(fù)四次。收集所有上清液室溫下1500 轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，細(xì)胞重懸后以 5×104cells/cm2密 度 鋪 皿 培 養(yǎng)， 加 入 0.1 ml/ L BrdU。 24小時后換液備實(shí)驗(yàn)用。

小干擾RNA干預(yù)：針對大鼠Bim的siRNA購自美國Sigma公司（參考序列編號：NM_022612）。大鼠ERK5特異性siRNA設(shè)計(jì)序列如下：＃1：5'-CAGUCACUUGUGCCACCUATT-3'＃ 2：5'-GGAGGAAUUCUUAAACCAATT-3';＃ 3：5'-GGCCCUGUAUCUCAGACUATT-3'（參考序列編號：NM_002749）。胰蛋白酶消化心肌細(xì)胞，接種于60毫米規(guī)格平皿，培養(yǎng)24小時后轉(zhuǎn)染siRNA。使用脂質(zhì)體為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，以非編碼siRNA作為對照。轉(zhuǎn)染 48小時后，用于低溫刺激干預(yù)。

低溫刺激干預(yù)：低溫刺激設(shè)定為：細(xì)胞置于35℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，每天8小時，共干預(yù)4天（共計(jì)32小時的低溫刺激）。低溫刺激外的時間，細(xì)胞置于正常培養(yǎng)條件下（37℃，5%CO2）。對照組設(shè)定為正常37℃，5%CO2條件中全程培養(yǎng)4天。

實(shí)驗(yàn)分組：對照組；低溫刺激組；低溫刺激加非編碼siRNA即陰性對照組；低溫刺激加Bim siRNA組（加Bim組）；低溫刺激加ERK5 siRNA組（加ERK5組）；低溫刺激加ERK5 siRNA、Bim siRNA共轉(zhuǎn)染組（共轉(zhuǎn)染組）。所有實(shí)驗(yàn)檢測均重復(fù)3次。

蛋白質(zhì)的提取和免疫印跡分析：胰酶消化法收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，蛋白提取遵試劑盒說明書。通過蛋白定量分析儀（德國Eppendorf公司）進(jìn)行蛋白定量，-20℃儲存蛋白樣本用于免疫印跡分析（Western blot）?？偟鞍滋崛∥镆?%凝膠電泳后半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，予以1:200稀釋的BimEL、ERK5 / 磷酸化ERK5抗體，1:2000稀釋的β-肌動蛋白抗體孵育過夜。TBST緩沖液洗膜，室溫下以1:10000稀釋的抗山羊IgG-HRP孵育60分鐘。TBST緩沖液洗滌后，暴露于化學(xué)發(fā)光試劑，曝光膠片。條帶量化分析使用Image J軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）。

細(xì)胞凋亡檢測：采用 Annexin V-FITC / PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，以流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測細(xì)胞凋亡。Annexin V-FITC可識別細(xì)胞凋亡， PI作為非特異性的DNA染料，可結(jié)合非存活細(xì)胞。Annexin V-FITC陽性細(xì)胞總百分比視為總細(xì)胞凋亡率。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平檢測：以 5 μmol/ L Fluo-3AM 加載細(xì)胞，在37℃孵育30分鐘，488 nm氬激光流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測（美國BD公司）。記錄1×104個事件，計(jì)算熒光強(qiáng)度。細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的數(shù)值計(jì)算公式為：[Ca2+]i（nmol / L）= KD（F-F）/（Fmax-F）。Kd=400 nmol / L。Fmax為加入鈣離子載體后的測量值，F(xiàn)min為加入鈣離子螯合劑乙二胺四乙酸后的測量值[10]。

ROS檢測：6 - 羧基 H2DCFHDA 作為細(xì)胞滲透性染料，可被活性氧氧化成高度熒光物質(zhì)，用以測量各組細(xì)胞內(nèi)ROS[11]。熒光測定條件設(shè)定為在488 nm激發(fā)，測量值單位表示為AU。

線粒體膜電位檢測：線粒體膜電位（ΔΨm）通過JC-1染料結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測。 JC-1可聚集在完整的線粒體，發(fā)出明亮的紅色熒光。線粒體膜電位中斷時， JC-1染料聚集受到抑制，以單體形式保持在細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)出綠色熒光。 37℃下使用 10 μg/ml JC-1孵育細(xì)胞15分鐘。熒光顯微鏡下觀察紅色和綠色熒光。重懸細(xì)胞后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，進(jìn)行單向方差分析（ANOVA）。方差不齊時使用秩和檢驗(yàn)。P＜0. 05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖表由GraphPad Prism 4.0 軟件生成。

2 結(jié)果

與對照組比較，低溫刺激組、加ERK5組、陰性對照組的Bim蛋白表達(dá)明顯增加（低溫刺激組：1.04±0.09，加ERK5組：1.54±0.14，陰性對照組：1.04±0.08 vs 對照組：0.24±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 與低溫刺激組比較，加ERK5組Bim蛋白表達(dá)明顯增加（低溫刺激組：1.04±0.09 vs 加 ERK5 組：1.54±0.14，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A）。低溫刺激組與對照組比較，心肌細(xì)胞的ERK5蛋白表達(dá)無明顯差異，但磷酸化ERK5蛋白表達(dá)增高（低溫刺激組：0.84±0.05 vs 對照組 0.41±0.02，P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。低溫刺激組與加Bim組比較， Bim siRNA不影響ERK5表達(dá)，但磷酸化ERK5蛋白表達(dá)減低（低溫刺激組：0.84±0.05 vs 加Bim組：0.49±0.03，P＜0.01）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖1B

圖1 在低溫刺激干預(yù)下的心肌細(xì)胞中，ERK5 siRNA對Bim蛋白表達(dá)的影響（1A），以及Bim siRNA對ERK5 / p-ERK5蛋白表達(dá)的影響(1B)

細(xì)胞凋亡率檢測示低溫刺激組比對照組凋亡率明顯增高[低溫刺激組：（32.45±2.01）% vs 對照組：（9.08±1.46）%，P＜0.01]。 Bim siRNA緩解低溫刺激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，加Bim組比低溫刺激組明顯減低 [加 Bim 組：（15.88±1.02）% vs 低溫刺激 組 :（32.45±2.01）%，P＜0.01]， 而 加 ERK5組的ERK5 siRNA導(dǎo)致凋亡率比低溫刺激組進(jìn)一步增高[加ERK5組：（41.30±4.21）%vs 低溫刺激組:（32.45±2.01）%，P＜0.01]。Bim siRNA 可取消 ERK5 siRNA的促凋亡作用，加ERK5組比共轉(zhuǎn)染組明顯降低[加ERK5組：（41.30±4.21）% vs 共轉(zhuǎn)染組：（27.01±2.82）%，P＜0.05]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖2

低溫刺激下的心肌細(xì)胞內(nèi)存在鈣離子超載，低溫刺激組明顯高于對照組[低溫刺激組：（625±27）nmol / L vs 對照組：（361± 52） nmol/L，P＜0.01]。Bim siRNA減弱低溫刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，加Bim組明顯低于低溫刺激組[加Bim組：（469±33）nmol/L vs 低溫刺激組：（625±27） nmol/L，P＜0.05]。ERK5 siRNA則加重低溫刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，加ERK5組明顯高于低溫刺激組[加ERK5組：（1154±56）nmol/L vs 低溫刺激組：（625±27） nmol/L，P＜0.01]。Bim siRNA 可代償 ERK5 siRNA 的鈣離子超載效應(yīng)，共轉(zhuǎn)染組明顯低于加ERK5組[共轉(zhuǎn)染組：（673±59） nmol/L vs 加 ERK5 組：（1154±56） nmol/L，P＜0.01]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。非編碼siRNA對細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平無影響。

低溫刺激在心肌細(xì)胞中誘導(dǎo)ROS水平增高，低溫刺激組明顯高于對照組（低溫刺激組：10.08±0.85 vs 對 照 組：3.61±0.71，P＜0.01 ），Bim siRNA 可抑制此低溫誘導(dǎo)的ROS爆發(fā)，加Bim組明顯低于低溫刺激組（加 Bim 組：4.82±0.48 vs 低溫刺激組：10.08±0.85，P＜0.01）。 ERK5 siRNA 誘 發(fā) 更 嚴(yán) 重的ROS激活，加ERK5組明顯高于低溫刺激組（加ERK5 組：18.34±1.22 vs 低 溫刺 激組：10.08±0.85，P＜0.01）， Bim siRNA 則可緩解 ERK5 siRNA 對 ROS活性的增強(qiáng)，共轉(zhuǎn)染組明顯低于加ERK5組（共轉(zhuǎn) 染 組：10.02±0.87 vs 加 ERK5 組：18.34±1.22，P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4

圖2 ERK5 siRNA以及Bim siRNA 對低溫刺激下心肌細(xì)胞凋亡的影響。流式細(xì)胞散點(diǎn)圖（2A）；各組凋亡率（2B）

圖3 ERK5 siRNA以及Bim siRNA 對低溫刺激下心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載的影響。余注見圖1

圖4 ERK5 siRNA以及Bim siRNA對低溫刺激下心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧活動的影響。余注見圖1

心肌細(xì)胞線粒體膜電位在低溫刺激下受到破壞，低溫刺激組明顯低于對照組（低溫刺激組：51.32±5.57 vs 對 照 組：83.29±7.2，P＜0.01），Bim siRNA可恢復(fù)低溫刺激損害的ΔΨm，加Bim組明顯高于低溫刺激組（加Bim組：69.26±7.13 vs 低溫刺激組：51.32±5.57，P＜0.01），ERK5 siRNA誘導(dǎo)更嚴(yán)重的ΔΨm破壞，加ERK5組明顯低于低溫刺激組（加ERK5組：30.42±8.32 vs 低溫刺激組：51.32±5.57，P＜0.01），而 Bim siRNA可代償ERK5 siRNA對ΔΨm的破壞，共轉(zhuǎn)染組明顯高于加 ERK5組（共轉(zhuǎn)染組：47.18±5.11 vs 加ERK5 組：30.42±8.32，P＜0.01 ）。圖 5

圖5 ERK5 siRNA以及Bim siRNA對低溫刺激下心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的影響。余注見圖1

3 討論

低體溫一般指身體核心溫度低于35℃，是對人類機(jī)體存在潛在危害的病理狀態(tài)[12]。 低溫刺激對心臟的損害作用已被廣泛報(bào)道，心肌細(xì)胞損傷及凋亡是重要環(huán)節(jié)。研究表明極短時間的低溫預(yù)處理可緩解心肌缺血再灌注損傷，提高再灌注期間心臟泵功能，發(fā)揮抗心律失常作用[13]，提示低溫刺激并非誘導(dǎo)心肌細(xì)胞迅速壞死，而是緩慢的細(xì)胞凋亡。本研究證實(shí)了低溫刺激下心肌細(xì)胞以凋亡為主，而非細(xì)胞完全死亡。

低溫刺激在亞細(xì)胞水平產(chǎn)生多方面的病理變化。作為氧代謝水平極高的細(xì)胞種類，心肌細(xì)胞可產(chǎn)生一系列 ROS ，過高水平的ROS誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。有研究報(bào)道，低溫刺激可使離體灌流心臟中的活性氧水平增高，并由此損害心肌細(xì)胞線粒體生物能[14]。此外，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載可導(dǎo)致：線粒體氧化磷酸化障礙；線粒體膜電位下降；ATP代謝水平降低；細(xì)胞質(zhì)磷脂酶和蛋白酶激活，這些均可導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞損害[15]。故此，ROS爆發(fā)，Ca2+超載和線粒體膜電位的破壞之間存在并發(fā)關(guān)系。本研究證實(shí)ROS爆發(fā)與細(xì)胞內(nèi)鈣超載均參與低溫刺激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，同時證實(shí)了線粒體膜電位損壞，在低溫刺激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷發(fā)揮重要作用，并與前述的低溫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載趨勢相吻合。

研究報(bào)道ERK與B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2）家族通過線粒體途徑密切參與細(xì)胞凋亡激活[16]。本研究在低溫刺激下的心肌細(xì)胞中檢測到明確的Bim蛋白高表達(dá)。通過RNA干擾技術(shù)我們下調(diào)Bim表達(dá)，獲得細(xì)胞凋亡率降低、ROS水平減低、鈣超載和線粒體膜電位破壞緩解等效應(yīng)。結(jié)果高度提示Bim作為促凋亡蛋白在低溫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及損傷中發(fā)揮重要作用。我們同時發(fā)現(xiàn)低溫刺激下的心肌細(xì)胞中，ERK5以及磷酸化的ERK5 存在高表達(dá)，下調(diào)Bim可抑制ERK5磷酸化并起保護(hù)性作用，緩解細(xì)胞凋亡、ROS爆發(fā)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載以及線粒體膜電位障礙。下調(diào)ERK5則促進(jìn)Bim蛋白表達(dá)，并加重上述低溫誘導(dǎo)的一系列亞細(xì)胞水平損傷。結(jié)果充分體現(xiàn)了ERK5作為Bim上游抑制物的作用，以及ERK5 / Bim間存在負(fù)反饋關(guān)系。

綜上所述，在低溫刺激下的心肌細(xì)胞中，下調(diào)ERK5可釋放對Bim的表達(dá)抑制，誘導(dǎo)更高的細(xì)胞凋亡率，以及更嚴(yán)重的細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、ROS活動、線粒體膜電位損傷。下調(diào)Bim則發(fā)揮反向的保護(hù)性作用。結(jié)果顯示ERK5/ Bim途徑在低溫刺激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中的明確調(diào)控作用。

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