張晉源，陳彥，肖玲，唐茜，王蓓，范艷鋒

研究證實(shí)阻塞型睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）患者易合并高血壓、擴(kuò)張型心肌病等疾患[1]，中、重度OSAHS患者普遍存在左心室肥厚[2]。研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張性心肌病在藥物基礎(chǔ)上使用無(wú)創(chuàng)呼吸機(jī)后，心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生可逆性改變[3]。該病表現(xiàn)為心肌肥厚[4]，目前多采用鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II（CaMKII）與心肌營(yíng)養(yǎng)素-1(CT-1)作為心肌肥厚損傷評(píng)價(jià)指標(biāo)，兩者持續(xù)過(guò)度激活與心臟重構(gòu)密切相關(guān)[5]。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)中受體1過(guò)度表達(dá)是導(dǎo)致心血管疾病的原因之一[6]。利莫那班阻斷大麻素受體1, 改善肥胖、糖代謝紊亂等，從而可降低心血管事件危險(xiǎn)因素。那么，OSAHS患者存在的心肌肥厚是否與內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)紊亂相關(guān)呢？本研究旨在通過(guò)慢性間歇低氧模型探討內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在心肌肥厚病理過(guò)程中的作用，并觀察使用利莫那班后對(duì)其的影響。

1 材料與方法

材料：①動(dòng)物：2012-11至2013-07選取普通級(jí)雄性Wistar大鼠48只，體重200～250 g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。48只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照即根據(jù)充氣時(shí)間又分為正常對(duì)照4周組，正常對(duì)照6周組；間歇低氧大鼠即根據(jù)低氧時(shí)間又分為低氧4周組，低氧6周組；間歇低氧+利莫那班干預(yù)即根據(jù)低氧時(shí)間又分為間歇低氧4周+利莫那班組（簡(jiǎn)稱低氧拮抗4周組），低氧拮抗6周組。共6組，每組均為8只。②主要試劑：兔抗鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II-CaMKIIα/δ（M281）抗體購(gòu)于Bioworld（Minnesota，USA）公司，CT-1抗體、鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物免疫組化染色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，利莫那班（SR141716）購(gòu)于Selleckchem（Texas，USA ）。

慢性間歇低氧模型的制備：每天分別循環(huán)充入不同流速的壓縮空氣（5 L/min及10 L/min）和純氮，每一循環(huán)為120 s，先充入純氮使低氧艙中氧含量在30 s內(nèi)從21%分別下降至各組最低值（8%～9%），再充入50 s以上不同流速壓縮空氣使艙內(nèi)氧含量盡快恢復(fù)至接近 21%，最后充入 40 s 5 L/min 壓縮空氣使艙內(nèi)氧含量以21%維持至下個(gè)循環(huán)。大鼠每天暴露8 h（9：00 am～5：00 pm）。干預(yù)的各組每天造模前腹腔內(nèi)注射利莫那班每只大鼠1 mg/kg，0.5 h后開(kāi)始通氣。

大鼠標(biāo)本處理:分別于間歇低氧4周及6周后隨機(jī)抽取各組一半數(shù)目大鼠，給予以下處理：10%的水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射后，剪開(kāi)胸廓，立即取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水漂洗，沿房室交界處剪去血管根部，左、右心房及心耳， 沿室間隔分離出左心室（含室間隔），用濾紙吸干，稱左心室重量，并計(jì)算左心室重量與體重之比，作為左心室肥厚指標(biāo)，即左心室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）[7]。再注入4%多聚甲醛300～350 ml固定液，在4%多聚甲醛中4℃固定24 h，石蠟包埋，切片。蘇木素伊紅（HE）染色，光鏡下觀察心肌變化：常規(guī)脫蠟至水后，HE染色10 min、水洗 ，然后 1% 鹽酸酒精分化 1～2 s 、水洗，再經(jīng)過(guò)1%氨水返藍(lán)液1～2 min、水洗， 0.5%水溶性伊紅 10 s～1 min、水洗，接著乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)變化。

免疫組化鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法：檢測(cè)CaMKII α/δ、CT-1在心臟表達(dá)水平，參照文獻(xiàn)[8]。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：計(jì)量資料用x±s表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，兩樣本均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)兩樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫組化半定量分析顯示間歇低氧和利莫那班干預(yù)對(duì)大鼠心肌左心室質(zhì)量指數(shù)比較。（表1）

表1 免疫組化半定量分析顯示間歇低氧和利莫那班干預(yù)對(duì)大鼠心肌CaMKⅡ、CT-1水平的影響（n=8,±s）

由表1可見(jiàn)，低氧4周組、低氧6周組表達(dá)分別強(qiáng)于正常對(duì)照組4周組（t=108.674，P＜0.001）、正常對(duì)照6周組（t=387.553，P＜0.001）；低氧6周組表達(dá)強(qiáng)于低氧4周組（t'=6.278，P＜0.001）；低氧4周組、低氧6周組表達(dá)分別強(qiáng)于低氧拮抗4周組（t'=59.818，P＜0.001）、低氧拮抗6周組（t=96.462，P＜0.001）；低氧拮抗6周組表達(dá)強(qiáng)于低氧拮抗4周組（t=205.897，P＜0.001），組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

病理組織學(xué)所見(jiàn)：心肌組織病理學(xué)改變：光鏡下① 正常對(duì)照4周組：心肌細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)肥大，間質(zhì)中無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；②低氧4周組：心肌細(xì)胞輕度肥大，胞漿豐富，胞核增大；③低氧拮抗4周組：心肌細(xì)胞間距稍有增大，少許炎細(xì)胞浸潤(rùn)；④ 正常對(duì)照6周組：未見(jiàn)心肌細(xì)胞肥大；⑤低氧6周組：細(xì)胞間距增大，胞漿豐富、著色深，胞核增大呈濃染，心肌纖維增粗、排列紊亂，血管周圍少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，間隙有紅細(xì)胞滲出；⑥低氧拮抗6周組：間隙增寬，胞漿凝聚，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，紅細(xì)胞滲出。（圖1）

圖1 心肌組織病理學(xué)改變(HE ×400)

CaMKⅡ、CT-1在心肌組織的免疫組化表達(dá)（圖2、3，以下數(shù)值t1、P1為CaMKⅡ的數(shù)值，t2、P2為CT-1的數(shù)值）：正常對(duì)照4周組、正常對(duì)照6周組大鼠心肌組織中有少量CaMKⅡ、CT-1表達(dá)（低表達(dá)），CaMKⅡ分布于胞漿及胞核，CT-1分布于胞漿；低氧4周組和低氧拮抗4周組（弱陽(yáng)性表達(dá)），低氧6周組和低氧拮抗6周組CaMKⅡ、CT-1表達(dá)明顯增強(qiáng)（強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)），陽(yáng)性著色明顯升高[免疫組化圖片 CaMK Ⅱ見(jiàn)圖 2（A～G）、 CT-1 見(jiàn)圖 3（A～F）]，CaMKⅡ分布于胞漿及胞核，CT-1分布于胞漿，其中低氧4周組表達(dá)強(qiáng)于正常對(duì)照4周組（t1'=4.952，P1＜0.001、t2=4.963，P2＜0.001）、低氧 6 周組表達(dá)強(qiáng)于正常對(duì)照6周組（t1=11.765，P1＜0.001、t2'=13.943，P2＜0.001）、低氧6周組表達(dá)強(qiáng)于低氧4周組（t'1=2.902，P1＜0.005、t2'=6.278，P2＜0.001）、 低 氧 4 周 組 表 達(dá)強(qiáng)于低氧拮抗4周組（t'1=2.653，P1=0.01、t2=2.422，P2＜0.05）、低氧6周組表達(dá)強(qiáng)于低氧拮抗6周組（t1=6.970，P1＜ 0.001、t2=4.250，P2＜0.001），低氧拮抗6周組表達(dá)強(qiáng)于低氧拮抗4周組（t'1=2.54，P1＜0.014、t2'=5.555，P2＜0.001），組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組大鼠平均光密度值詳見(jiàn)表1。CT-1與CaMKⅡ呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.426，P＜0.01。

圖2 CaMKⅡ在心肌組織免疫組化表達(dá) （DAB ×400）。余注見(jiàn)表1

圖3 CT-1在心肌組織免疫組化表達(dá) （DAB ×400）。余注見(jiàn)表1

3 討論

夜間反復(fù)發(fā)生的慢性間歇低氧是OSAHS最主要病理生理改變，其可參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、心臟自主神經(jīng)功能紊亂等多種過(guò)程，被認(rèn)為是心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

越來(lái)越多的證據(jù)顯示對(duì)于心血管疾病而言O(shè)SAHS是一個(gè)重要的可干預(yù)的危險(xiǎn)因素，但具體機(jī)制尚未清楚。左心室重量指數(shù)、CaMKⅡ、CT-1是心肌肥厚損傷常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)，三者與心律失常、心室重塑等密切相關(guān)，國(guó)外研究已證實(shí)在實(shí)驗(yàn)性心肌病狀態(tài)下CaMKⅡ、CT-1出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)[9]，因此檢測(cè)三者的表達(dá)可明確反映心肌肥厚的變化。而在本研究同樣發(fā)現(xiàn)慢性間歇低氧模型低氧組大鼠心肌組織中左心室質(zhì)量指數(shù)值以及CaMKⅡ、CT-1表達(dá)明顯增加，并隨著低氧周數(shù)的延長(zhǎng)表達(dá)增加更明顯。

既然慢性間歇低氧中確實(shí)發(fā)生了心肌肥厚，那么其機(jī)制是什么呢？目前關(guān)于OSAHS導(dǎo)致心肌肥厚可能與以下幾個(gè)方面相關(guān)：①自主神經(jīng)功能紊亂；②氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)；③血管內(nèi)皮損害；④血流粘度增高、高凝狀態(tài)、纖溶系統(tǒng)異常；⑤內(nèi)分泌代謝異常；⑥胸腔內(nèi)壓的改變，但其具體機(jī)制仍在進(jìn)一步探討。

本課題組前期臨床實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)OSAHS患者存在內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)紊亂，內(nèi)源性大麻素紊亂可導(dǎo)致糖代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥因子活化、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂以及體溫調(diào)節(jié)障礙等多系統(tǒng)的病理過(guò)程，并且被認(rèn)為是心血管事件的危險(xiǎn)因素。那么內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)紊亂與心肌肥厚是否存在關(guān)聯(lián)呢？

大麻素受體1是內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的主要受體，由于內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)調(diào)節(jié)體內(nèi)多種生理功能均通過(guò)大麻素受體1完成[10]，因此目前研究多通過(guò)檢測(cè)大麻素受體1來(lái)評(píng)價(jià)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)變化。由于大麻素受體1主要表達(dá)于肝臟、胃腸道、胰腺和脂肪細(xì)胞，但其在心肌中表達(dá)較少。因此直接測(cè)定其在心肌中表達(dá)并不容易，本研究采用內(nèi)源性大麻素受體拮抗劑利莫那班預(yù)先干預(yù)，旨在從另一層面證實(shí)心肌肥厚中該系統(tǒng)所發(fā)揮的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用利莫那班組大鼠心肌組織中CaMKⅡ 、CT-1表達(dá)較單純低氧組明顯減少，提示利莫那班對(duì)慢性間歇低氧所造成的心肌細(xì)胞損害有一定保護(hù)作用，從而證實(shí)OSAHS導(dǎo)致的慢性間歇低氧可發(fā)生內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)紊亂，最終導(dǎo)致心肌肥厚發(fā)生。分析其原因可能為：①內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)活性升高不僅具有增加食欲促進(jìn)攝食等中樞性作用，同時(shí)還影響周圍組織能量代謝，引起體重增加，引發(fā)血脂異常；②內(nèi)源性和外源性大麻系統(tǒng)可能表現(xiàn)出對(duì)心血管系統(tǒng)直接影響，心肌、血管及神經(jīng)末梢大麻素受體激活后能夠觀察到明顯生理效應(yīng)；③內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)過(guò)度激活促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥；④內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)導(dǎo)致胰島素抵抗。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)過(guò)度活躍導(dǎo)致以上心血管代謝危險(xiǎn)發(fā)生，進(jìn)而引起心肌肥厚。而利莫那班選擇性阻斷大麻素受體1，可以顯著降低體重，并且在出現(xiàn)超重或肥胖、促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的血脂紊亂、高血壓及2型糖尿病的高危人群中可以改善若干代謝危險(xiǎn)因素。通過(guò)利莫那班阻斷大麻素受體1，從而降低心血管事件危險(xiǎn)因素。

綜上所述，OSAHS患者出現(xiàn)心肌肥厚病理改變的可能機(jī)制之一為內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的紊亂，而提早使用利莫那班干預(yù)可減少心肌肥厚病理過(guò)程，對(duì)慢性間歇低氧導(dǎo)致的心肌損害具有一定保護(hù)作用，這為進(jìn)一步減輕慢性間歇低氧造成的心肌損害提供了一定的臨床思路。

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