高萌+李明仙+李宇赤+王婉麗+李光

[摘要]目的 測定麗江產瑪咖中必需氨基酸的含量。方法 以2，4-二硝基氟苯為衍生試劑，與麗江產瑪咖中18種氨基酸柱前衍生，用Waters 600高效液相色譜儀，菲羅門公司Symmetry C18色譜柱，以含1% N，N-二甲基甲酰胺的0.05mol/L醋酸鈉-醋酸緩沖液（pH=6.4）及乙腈∶水（1∶1）進行梯度洗脫，檢測波長為360nm，柱溫為35℃，進樣量為20μL。結果 18種氨基酸的線性回歸方程r值為0.9995～1.0000（n=5），平均回收率為99.54%～101.84%，RSD值為0.38%～1.82%，n=6。結論 本法快速、簡便，結果準確。

[關鍵詞] 柱前衍生化；瑪咖；氨基酸；2，4-二硝基氟苯；高效液相色譜法

[中圖分類號] Q517 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）06-33-05

Maca（lepidium meyenii walp.，一般音譯為“瑪咖”）是十字花科（cruciferae）獨行菜屬（lepidium）一年生或兩年生的草本植物，原產于秘魯海拔3500～4000m左右的胡寧（Junin）和帕斯克（Pasco）狹長地帶[1]?，斂г谀厦赖氖秤脷v史已經有5800多年，傳統(tǒng)上作為食物和草藥，可改善性功能[2]，提高生育力，抗疲勞[3]，抗腫瘤和用于治療抑郁癥、哮喘癥和女性更年期綜合征等?，斂е泻胸S富的蛋白質、氨基酸、牛磺酸、礦物質鋅[4]等與免疫調節(jié)相關的化學成分，而且傳統(tǒng)上瑪咖就具有顯著的增強精力的“適應原樣作用”[5]。目前，以瑪咖為原料的保健食品、食品日益增多[6]，但鮮有相關質量控制方法方面報道，氨基酸作為其保健主要成分，建立

成熟的氨基酸測定方法，可為瑪咖鑒別、質量控制、商品規(guī)格劃分提供參考。

大多數氨基酸無紫外吸收和熒光發(fā)射特征，為提高分析檢測靈敏度和分離選擇特性，通常將氨基酸進行衍生化。目前已經報道的用于氨基酸柱前衍生的衍生試劑有多種[7-12]，不同的衍生劑都有各自的不足，而2，4-二硝基氟苯（DNFB）衍生化方法因其試劑價格低廉，操作簡便，所得產物相對穩(wěn)定等優(yōu)點而被廣泛應用，本實驗參考文獻[13-14]采用該方法柱前衍生化測定麗江瑪咖中總氨基酸類成分，同樣考察水解因素及衍生化因素對結果的影響，有望為建立瑪咖藥材質量控制方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

瑪咖購自麗江產地；醋酸（分析純，天津市光復精細化工研究所）；2，4-二硝基氟苯（分析純，成都格雷西亞化學技術有限公司）；醋酸鈉（分析純，成都格雷西亞化學技術有限公司）；碳酸鈉（分析純，成都格雷西亞化學技術有限公司）；乙腈（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；氫氧化鈉（分析純，成都格雷西亞化學技術有限公司）；色譜純乙腈（美國 Fisher公司）；N，N-二甲基甲酰胺（分析純，成都格雷西亞化學技術有限公司）；苯酚（分析純，成都格雷西亞化學技術有限公司）；磷酸二氫鉀（分析純，成都格雷西亞化學技術有限公司）；pH為7.0的磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L氫氧化鈉溶液29.1mL溶解0.68g磷酸二氫鉀，蒸餾水定容至100mL）；門冬氨酸等氨基酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為140624-200805）。

1.2 實驗儀器

Waters 高效液相色譜儀，Empower色譜工作站（美國沃特世公司）；數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；分析天平（賽多利斯公司）；電子天平（賽多利斯公司）；TGL16M湘智離心機（安徽誠信啟動設備有限公司）；酒精噴燈（上饒市教儀廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Symmetry C18柱（5μm，4.6×250mm）。流動相：A泵：含1%N，N-二甲基甲酰胺的0.05mol/L醋酸鈉-醋酸緩沖液（pH=6.4）。B泵：乙腈∶水（1∶1）。檢測波長：360nm；流速：1mL/min；柱溫：30℃。梯度洗脫程序見表1。

1.3.2 標準溶液的配制 分別精密稱取氨基酸對照品適量，加入蒸餾水定容至50mL，精密量取1mL置安瓿瓶中，加入0.5mol/L碳酸鈉溶液混勻，再加入1% DNFB乙腈溶液1mL，震蕩，密封于50℃水浴避光反應90min，反應結束后，加入磷酸鹽緩沖液定容至10mL，作為對照品溶液。

1.3.3 樣品處理 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置于安瓿瓶中，加入10mL含3%苯酚的6mol/L鹽酸溶液，密封后于105℃水解22h，反應完成后后80℃水浴蒸干，加入少量蒸餾水超聲溶解后定容至10mL。取1mL定容后溶液，按“1.3.2項下”標準溶液配制方法進行反應，反應結束后放置至室溫，過0.45μm微孔濾膜，備用。

1.3.4 衍生化條件的優(yōu)化

1.3.4.1 衍生化試劑用量考察 取1.3.3項中定容后溶液1mL，分別加入衍生化試劑各1、2、3、4、5mL，與60℃衍生化60min，過濾后進樣。

1.3.4.2 衍生化時間考察 取1.3.3項中定容后溶液1mL，加入衍生化試劑各2mL，與60℃水浴中分別加熱30、60、90、120min，過濾后進樣。

1.3.4.3 衍生化溫度考察 取1.3.3項中定容后溶液1mL，加入衍生化試劑各2mL，分別在40、50、60、70、80℃水浴中加熱60min，過濾后進樣。

1.3.5 水解條件的優(yōu)化

1.3.5.1 鹽酸用量考察 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置于安瓿瓶中，分別加入5、10、15mL含3%苯酚的6mol/L鹽酸溶液，按“1.3.3項下”方法處理最終定容至10mL。各取1mL溶液加入衍生化試劑2mL，與60℃避光反應60min，濾液采用0.45μm微孔濾膜過濾，備用進樣。endprint

1.3.5.2 水解時間考察 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置于安瓿瓶中，按“1.3.3項下”方法處理水解改變?yōu)?0、22、24h，最終定容為10mL。各取1mL溶液加入衍生化試劑2mL，與60℃水浴中分別加熱反應60min，0.45μm微孔濾膜過濾，備用進樣。

1.3.5.3 水解溫度考察 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置安瓿瓶中，按“1.3.3項下”方法處理水解溫度改變?yōu)?05、100、110℃水解22h，最終定容為10mL。各取1mL溶液加入衍生化試劑2mL，與60℃水浴中分別加熱反應60min，0.45μm微孔濾膜過濾，備用進樣。

1.3.5.4 苯酚用量考察 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置于安瓿瓶中，加入10mL分別含苯酚0%、1%、3%、5%的6mol/L鹽酸溶液，按“1.3.3項下”方法處理最終定容為10mL。各取1mL溶液加入衍生化試劑2mL，與60℃水浴中分別加熱反應60min，0.45μm微孔濾膜過濾，備用進樣。

2 結果

2.1 衍生化條件優(yōu)化

以所得色譜圖中除衍生化試劑峰外色譜峰峰面積為考察指標，比較不同衍生化條件下對峰面積的影響，結果如圖1～3所示。

2.2 水解條件優(yōu)化

以所得色譜圖中除衍生化試劑峰外色譜峰峰面積為考察指標，將1.3.4項下樣品進樣，比較不同衍生化條件下對峰面積的影響，結果如圖4～7所示。

2.3 重復性試驗

精密量取水解后定容樣品溶液1mL，按供試品制備方法進行制備樣品，重復進行5次，分別測定樣品中各氨基酸峰面積的相對標準偏差。測得RSD范圍為0.908%～1.876%，RSD<2%，說明試驗重現性結果良好。

2.4 精密度試驗

取“1.3.3項”下供試品制備的樣品，連續(xù)進樣6次，分別計算樣品中各氨基酸峰面積的相對標準偏差。測得RSD范圍為0.568%～1.962%，說明儀器精密度較好。

2.5 線性關系測定

稱取各氨基酸對照品適量，蒸餾水溶解后定容至100mL，分別精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置安瓿瓶中，按“1.3.3項”下方法制備供試品溶液。設置進樣量為2?L注入液相色譜儀，選取濃度與峰面積為橫縱坐標，計算線性方程，結果見表2。

實驗結果表明，各氨基酸對照品進樣濃度在上述范圍內，峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.6 溶液穩(wěn)定性實驗

精密量取水解后定容樣品溶液1mL按“1.3.3項”下方法制備供試品溶液。于0、2、4、6、8h進樣，測定5次。除組氨酸RSD為4.825%外，其他氨基酸基本穩(wěn)定。建議樣品溶液制備完后，立即測定。如果保存一段時間測定，應放到涼暗處，此方法制備供試品溶液可以在1h內完成，對樣品穩(wěn)定性要求不高。

2.7 回收率實驗

精密稱取各氨基酸對照品適量與樣品混合，按“1.3.3項”下供試品制備方法進行樣品制備。進樣后分析各氨基酸回收率。結果表明各氨基酸含量平均值在99.62%～101.13%，RSD在1.03%～1.83%，說明各氨基酸的回收率符合要求。

2.8 樣品測定

精密稱取麗江瑪咖樣品0.50g，按照“1.3.3項下”樣品制備方法制備進樣，所得結果如圖8～9及表3所示。

3 討論

瑪咖作為新資源食品已被廣泛認知，保健食品市場逐漸擴大，微量元素及氨基酸可能是其主要的保健功效成分，本文采用DNFB柱前衍生化方法對測定中各氨基酸的含量進行測定，該方法具有反應條件易于控制，操作簡便等優(yōu)點。實驗結果發(fā)現對氨基酸含量影響較大的衍生化因素為溫度與時間，溫度過高氨基酸含量降低，可能是由于持續(xù)高溫會破壞氨基酸結構造成氨基酸結構相互轉化，實驗中發(fā)現盡管反應條件不同，得到各氨基酸間比例變化，但總氨基酸量差異不大也從側面證實了該觀點，本實驗參考文獻報道[15]在酸水解液中加入苯酚是為了保護色氨酸基團不被破壞，最終確定加入3%含量的苯酚能夠達到很好的水解效果，并建議衍生化條件為溫度采用2倍量衍生化試劑，于50℃，反應90min。

[參考文獻]

[1] León J.The “Maca”（Lepidium meyenii），a little known food plant of Peru[J].Economic Botany，1964，18（2）：122-127.

[2] Gonzales GF，Cordova A，Gonzales C，et al.Lepidium meyenii（Maca） improved semen parameters in adult men[J].Asian Journal of Andrology，2001，3（4）：301-304.

[3] 文金隆，何芳雁，韓春妮，等.云南引種瑪咖對小鼠非特異性免疫、抗疲勞、耐缺氧功能的影響[J].云南中醫(yī)學院學報，2012，153（5）：4-7.

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[5] 肖培根，劉勇，肖偉.瑪卡——全球矚目的保健食品[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2006，18（4）：236-237.

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[8] 陳華萍，陳黎，魏育明，等.柱前衍生反相高效液相色譜法測定小麥中氨基酸含量[J].分析化學，2005（12）：1689-1692.

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[10] 朱曉偉，高新星，安芳，等.柱前衍生化HPLC-熒光檢測法測定高血壓患者尿液中22種游離氨基酸的濃度[J].中國藥房，2010，21（30）：2823-2825.

[12] 侯松嵋，孫敬，何紅波，等.AQC柱前衍生反相高效液相色譜法測定土壤中氨基酸[J].分析化學，2006 （10）： 1395-1400.

[13] 李光，李學蘭，陳曦.柱前衍生化HPLC法測定齒瓣石斛中總氨基酸的含量[J].中國藥房，2012，23（31）：2927-2930.

[14] 李光，李學蘭，陳曦.柱前衍生化法測定晶帽石斛中總氨基酸含量[J].醫(yī)藥導報，2012，31（2）：202-205.

[15] Muramoto K，Kamiya H.Recovery of tryptophan in peptides and proteins by high-temperature and short-term acid hydrolysis in the presence of phenol[J].Analytical Biochemistry，1990，189（2）：223-230.

（收稿日期：2013-12-11）endprint

1.3.5.2 水解時間考察 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置于安瓿瓶中，按“1.3.3項下”方法處理水解改變?yōu)?0、22、24h，最終定容為10mL。各取1mL溶液加入衍生化試劑2mL，與60℃水浴中分別加熱反應60min，0.45μm微孔濾膜過濾，備用進樣。

1.3.5.3 水解溫度考察 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置安瓿瓶中，按“1.3.3項下”方法處理水解溫度改變?yōu)?05、100、110℃水解22h，最終定容為10mL。各取1mL溶液加入衍生化試劑2mL，與60℃水浴中分別加熱反應60min，0.45μm微孔濾膜過濾，備用進樣。

1.3.5.4 苯酚用量考察 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置于安瓿瓶中，加入10mL分別含苯酚0%、1%、3%、5%的6mol/L鹽酸溶液，按“1.3.3項下”方法處理最終定容為10mL。各取1mL溶液加入衍生化試劑2mL，與60℃水浴中分別加熱反應60min，0.45μm微孔濾膜過濾，備用進樣。

2 結果

2.1 衍生化條件優(yōu)化

以所得色譜圖中除衍生化試劑峰外色譜峰峰面積為考察指標，比較不同衍生化條件下對峰面積的影響，結果如圖1～3所示。

2.2 水解條件優(yōu)化

以所得色譜圖中除衍生化試劑峰外色譜峰峰面積為考察指標，將1.3.4項下樣品進樣，比較不同衍生化條件下對峰面積的影響，結果如圖4～7所示。

2.3 重復性試驗

精密量取水解后定容樣品溶液1mL，按供試品制備方法進行制備樣品，重復進行5次，分別測定樣品中各氨基酸峰面積的相對標準偏差。測得RSD范圍為0.908%～1.876%，RSD<2%，說明試驗重現性結果良好。

2.4 精密度試驗

取“1.3.3項”下供試品制備的樣品，連續(xù)進樣6次，分別計算樣品中各氨基酸峰面積的相對標準偏差。測得RSD范圍為0.568%～1.962%，說明儀器精密度較好。

2.5 線性關系測定

稱取各氨基酸對照品適量，蒸餾水溶解后定容至100mL，分別精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置安瓿瓶中，按“1.3.3項”下方法制備供試品溶液。設置進樣量為2?L注入液相色譜儀，選取濃度與峰面積為橫縱坐標，計算線性方程，結果見表2。

實驗結果表明，各氨基酸對照品進樣濃度在上述范圍內，峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.6 溶液穩(wěn)定性實驗

精密量取水解后定容樣品溶液1mL按“1.3.3項”下方法制備供試品溶液。于0、2、4、6、8h進樣，測定5次。除組氨酸RSD為4.825%外，其他氨基酸基本穩(wěn)定。建議樣品溶液制備完后，立即測定。如果保存一段時間測定，應放到涼暗處，此方法制備供試品溶液可以在1h內完成，對樣品穩(wěn)定性要求不高。

2.7 回收率實驗

精密稱取各氨基酸對照品適量與樣品混合，按“1.3.3項”下供試品制備方法進行樣品制備。進樣后分析各氨基酸回收率。結果表明各氨基酸含量平均值在99.62%～101.13%，RSD在1.03%～1.83%，說明各氨基酸的回收率符合要求。

2.8 樣品測定

精密稱取麗江瑪咖樣品0.50g，按照“1.3.3項下”樣品制備方法制備進樣，所得結果如圖8～9及表3所示。

3 討論

瑪咖作為新資源食品已被廣泛認知，保健食品市場逐漸擴大，微量元素及氨基酸可能是其主要的保健功效成分，本文采用DNFB柱前衍生化方法對測定中各氨基酸的含量進行測定，該方法具有反應條件易于控制，操作簡便等優(yōu)點。實驗結果發(fā)現對氨基酸含量影響較大的衍生化因素為溫度與時間，溫度過高氨基酸含量降低，可能是由于持續(xù)高溫會破壞氨基酸結構造成氨基酸結構相互轉化，實驗中發(fā)現盡管反應條件不同，得到各氨基酸間比例變化，但總氨基酸量差異不大也從側面證實了該觀點，本實驗參考文獻報道[15]在酸水解液中加入苯酚是為了保護色氨酸基團不被破壞，最終確定加入3%含量的苯酚能夠達到很好的水解效果，并建議衍生化條件為溫度采用2倍量衍生化試劑，于50℃，反應90min。

[參考文獻]

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[2] Gonzales GF，Cordova A，Gonzales C，et al.Lepidium meyenii（Maca） improved semen parameters in adult men[J].Asian Journal of Andrology，2001，3（4）：301-304.

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[4] 彭珍華，楊凡，王仕興，等.ICP-MS同時測定瑪咖中16種稀土元素的研究[J].現代儀器與醫(yī)療，2013，19（2）：67-69.

[5] 肖培根，劉勇，肖偉.瑪卡——全球矚目的保健食品[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2006，18（4）：236-237.

[6] 胡強，康平德，楊少華，等.云南瑪咖種子產業(yè)化發(fā)展的現狀、優(yōu)勢與對策[J].種子，2013，32（1）：59-62.

[7] 渠琛玲，玉崧成，白雨萍，等.微波水解衍生高效液相色譜法測定西洋參中的氨基酸[J].分析化學，2009，37（5）： 685-690.

[8] 陳華萍，陳黎，魏育明，等.柱前衍生反相高效液相色譜法測定小麥中氨基酸含量[J].分析化學，2005（12）：1689-1692.

[9] 鄒秦文，肖新月，程顯隆，等.百令膠囊中17種氨基酸的柱前衍生化RP-HPLC法含量測定[J].藥物分析雜志，2010， 30（9）：1630-1635.

[10] 朱曉偉，高新星，安芳，等.柱前衍生化HPLC-熒光檢測法測定高血壓患者尿液中22種游離氨基酸的濃度[J].中國藥房，2010，21（30）：2823-2825.

[12] 侯松嵋，孫敬，何紅波，等.AQC柱前衍生反相高效液相色譜法測定土壤中氨基酸[J].分析化學，2006 （10）： 1395-1400.

[13] 李光，李學蘭，陳曦.柱前衍生化HPLC法測定齒瓣石斛中總氨基酸的含量[J].中國藥房，2012，23（31）：2927-2930.

[14] 李光，李學蘭，陳曦.柱前衍生化法測定晶帽石斛中總氨基酸含量[J].醫(yī)藥導報，2012，31（2）：202-205.

[15] Muramoto K，Kamiya H.Recovery of tryptophan in peptides and proteins by high-temperature and short-term acid hydrolysis in the presence of phenol[J].Analytical Biochemistry，1990，189（2）：223-230.

（收稿日期：2013-12-11）endprint

1.3.5.2 水解時間考察 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置于安瓿瓶中，按“1.3.3項下”方法處理水解改變?yōu)?0、22、24h，最終定容為10mL。各取1mL溶液加入衍生化試劑2mL，與60℃水浴中分別加熱反應60min，0.45μm微孔濾膜過濾，備用進樣。

1.3.5.3 水解溫度考察 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置安瓿瓶中，按“1.3.3項下”方法處理水解溫度改變?yōu)?05、100、110℃水解22h，最終定容為10mL。各取1mL溶液加入衍生化試劑2mL，與60℃水浴中分別加熱反應60min，0.45μm微孔濾膜過濾，備用進樣。

1.3.5.4 苯酚用量考察 精密稱取過3號篩樣品0.5000g置于安瓿瓶中，加入10mL分別含苯酚0%、1%、3%、5%的6mol/L鹽酸溶液，按“1.3.3項下”方法處理最終定容為10mL。各取1mL溶液加入衍生化試劑2mL，與60℃水浴中分別加熱反應60min，0.45μm微孔濾膜過濾，備用進樣。

2 結果

2.1 衍生化條件優(yōu)化

以所得色譜圖中除衍生化試劑峰外色譜峰峰面積為考察指標，比較不同衍生化條件下對峰面積的影響，結果如圖1～3所示。

2.2 水解條件優(yōu)化

以所得色譜圖中除衍生化試劑峰外色譜峰峰面積為考察指標，將1.3.4項下樣品進樣，比較不同衍生化條件下對峰面積的影響，結果如圖4～7所示。

2.3 重復性試驗

精密量取水解后定容樣品溶液1mL，按供試品制備方法進行制備樣品，重復進行5次，分別測定樣品中各氨基酸峰面積的相對標準偏差。測得RSD范圍為0.908%～1.876%，RSD<2%，說明試驗重現性結果良好。

2.4 精密度試驗

取“1.3.3項”下供試品制備的樣品，連續(xù)進樣6次，分別計算樣品中各氨基酸峰面積的相對標準偏差。測得RSD范圍為0.568%～1.962%，說明儀器精密度較好。

2.5 線性關系測定

稱取各氨基酸對照品適量，蒸餾水溶解后定容至100mL，分別精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置安瓿瓶中，按“1.3.3項”下方法制備供試品溶液。設置進樣量為2?L注入液相色譜儀，選取濃度與峰面積為橫縱坐標，計算線性方程，結果見表2。

實驗結果表明，各氨基酸對照品進樣濃度在上述范圍內，峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.6 溶液穩(wěn)定性實驗

精密量取水解后定容樣品溶液1mL按“1.3.3項”下方法制備供試品溶液。于0、2、4、6、8h進樣，測定5次。除組氨酸RSD為4.825%外，其他氨基酸基本穩(wěn)定。建議樣品溶液制備完后，立即測定。如果保存一段時間測定，應放到涼暗處，此方法制備供試品溶液可以在1h內完成，對樣品穩(wěn)定性要求不高。

2.7 回收率實驗

精密稱取各氨基酸對照品適量與樣品混合，按“1.3.3項”下供試品制備方法進行樣品制備。進樣后分析各氨基酸回收率。結果表明各氨基酸含量平均值在99.62%～101.13%，RSD在1.03%～1.83%，說明各氨基酸的回收率符合要求。

2.8 樣品測定

精密稱取麗江瑪咖樣品0.50g，按照“1.3.3項下”樣品制備方法制備進樣，所得結果如圖8～9及表3所示。

3 討論

瑪咖作為新資源食品已被廣泛認知，保健食品市場逐漸擴大，微量元素及氨基酸可能是其主要的保健功效成分，本文采用DNFB柱前衍生化方法對測定中各氨基酸的含量進行測定，該方法具有反應條件易于控制，操作簡便等優(yōu)點。實驗結果發(fā)現對氨基酸含量影響較大的衍生化因素為溫度與時間，溫度過高氨基酸含量降低，可能是由于持續(xù)高溫會破壞氨基酸結構造成氨基酸結構相互轉化，實驗中發(fā)現盡管反應條件不同，得到各氨基酸間比例變化，但總氨基酸量差異不大也從側面證實了該觀點，本實驗參考文獻報道[15]在酸水解液中加入苯酚是為了保護色氨酸基團不被破壞，最終確定加入3%含量的苯酚能夠達到很好的水解效果，并建議衍生化條件為溫度采用2倍量衍生化試劑，于50℃，反應90min。

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（收稿日期：2013-12-11）endprint