溫從吉 傅士博 周仁鵬 王丹茹

皮膚損傷后，纖維組織過(guò)度增生會(huì)形成增生性瘢痕，表現(xiàn)為隆起的紅色瘢痕，伴有慢性的炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重影響外觀，并可引起局部功能受限。增生性瘢痕的生理病理機(jī)制尚未完全清楚[1]，缺少有效的治療及預(yù)防手段。張力對(duì)增生性瘢痕的形成具有重要作用。增生性瘢痕的好發(fā)部位，如前胸部、肩部、肩胛區(qū)部及恥骨弓上方等，均系日?；顒?dòng)中持續(xù)或間斷地處于張力環(huán)境下[2]。減少創(chuàng)面局部張力，可一定程度上抑制瘢痕增生及病理性瘢痕的復(fù)發(fā)[3]。目前，常用的方法有彈力衣、硅膠膜及減張膠布等[4]。但由于動(dòng)物皮膚與人類(lèi)存在較大的不同，目前的研究尚缺少有效的增生性瘢痕動(dòng)物模型，無(wú)法在細(xì)胞及分子水平進(jìn)行深入研究。2007年，Aarabi等[5]在小鼠背部皮膚模擬人類(lèi)皮膚的張力環(huán)境形成了增生性瘢痕，類(lèi)似于人類(lèi)瘢痕，并能維持6個(gè)月以上。因此，我們研究該動(dòng)物模型，以驗(yàn)證該模型的有效性，及其是否可持續(xù)而穩(wěn)定表達(dá)增生性瘢痕特征。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡C57/BL6小鼠(中科院上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，20只，體質(zhì)量28±2 g，隨機(jī)分為兩組(n=10)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

小鼠麻醉下在背部縱向切開(kāi)2 cm，6-0尼龍線縫合，4 d后拆線。創(chuàng)面以6-0尼龍線安裝牽拉裝置，實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后第4天開(kāi)始牽拉，距離2 mm，之后隔天牽拉4 mm，至第14天；對(duì)照組安裝后不牽拉(圖1)。

圖1 機(jī)械牽拉裝置Fig.1Mechanical traction device

1.3 大體觀察

14 d后拆除裝置，牽引結(jié)束后1 d、30 d、60 d、90 d觀察小鼠瘢痕生長(zhǎng)情況，包括面積、顏色和質(zhì)地。

1.4 組織學(xué)觀察

牽引后1 d、30 d、60 d切取瘢痕組織，即刻4%多聚甲醛固定，脫水、透明、浸蠟、包埋，于瘢痕最凸起部位橫斷切片(厚度為5 μm)，分別行HE和MASSON染色。

1.5 瘢痕面積測(cè)量

瘢痕面積根據(jù)瘢痕橫斷面HE染色數(shù)字圖像進(jìn)行測(cè)量，隨機(jī)選取5個(gè)切片標(biāo)本，采用Image Pro-Plus 6.0軟件進(jìn)行分析，取平均值。

1.6 瘢痕細(xì)胞數(shù)目變化及膠原量變化情況

取牽引后1 d、30 d、60 d各時(shí)間段HE染色標(biāo)本，100倍視野下取5個(gè)區(qū)域，使用Image Pro Plus 6.0標(biāo)記，并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞核數(shù)目，取平均值(細(xì)胞數(shù)/區(qū)域)。切片MASSON染色，膠原組織染成藍(lán)色，取各時(shí)間段組織標(biāo)本，400倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域，Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)膠原比例(創(chuàng)面膠原/正常組織膠原×100%)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SAS 8.1軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，不同時(shí)間點(diǎn)組間比較采用t檢驗(yàn)，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀及瘢痕面積

通過(guò)14 d的機(jī)械牽引，小鼠背部創(chuàng)面可見(jiàn)明顯的瘢痕組織(4.09±0.31 mm2)，輕度隆起于皮膚表面，色紅，質(zhì)硬；牽引后30 d，瘢痕面積(3.5±0.2 mm2)較前縮小(P0.5)，瘢痕周?chē)律l(fā)組織生長(zhǎng)旺盛；牽引后60 d，瘢痕面積(1.52±0.12 mm2)進(jìn)一步縮小(P0.5)。牽引后90 d，瘢痕部位布滿毛發(fā)，中間隱約可見(jiàn)手術(shù)切口，瘢痕面積1.42±0.18 mm2。對(duì)照組去除裝置后當(dāng)天及牽拉后30 d瘢痕面積未見(jiàn)明顯改變(1.50±0.18 mm2vs 1.46±0.19 mm2，P0.5)(圖2、3)。

圖2 大體外觀圖Fig.2Gross images

圖3 瘢痕面積變化趨勢(shì)Fig.3The area changes of loaded scars over time

2.2 組織學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)組牽引后1 d創(chuàng)面新生表皮明顯增厚，局部增厚的表皮組織向下生長(zhǎng)，疑似有毛囊的再生(圖4)，肉膜組織切口處中斷，創(chuàng)面中央新生膠原組織填充，膠原中間布滿細(xì)胞，新生組織含新生血管組織較多；牽引后30 d，肉膜組織斷裂，表皮較前明顯變薄，瘢痕中央未見(jiàn)毛囊及皮脂腺等皮膚附屬器，膠原組織與表皮平行，毛細(xì)血管組織豐富，細(xì)胞數(shù)目較前減少，未見(jiàn)明顯的漩渦狀膠原結(jié)節(jié)；牽引后60 d，瘢痕組織的面積明顯縮小，但瘢痕中央部分膠原增粗且排列紊亂，兩側(cè)被含有毛囊新生組織替代。對(duì)照組術(shù)后30 d切口下方肉膜組織斷裂，但表皮及真皮組織完全愈合，未見(jiàn)明顯平行于表皮的纖維組織(圖5)。

圖4 牽引后1 d可見(jiàn)新生毛囊(MASSON染色)Fig.4Regenerative hair follicle was observed 1 days after traction by MASSON staining

圖5 組織學(xué)圖像Fig.5Histological images

2.3 瘢痕組織細(xì)胞數(shù)目及膠原變化

牽引后1 d，鏡下見(jiàn)組織內(nèi)布滿細(xì)胞(317±20個(gè)/區(qū)域)，膠原纖維主要為細(xì)而短的小纖維(0.1±0.02)；牽引后30 d，發(fā)現(xiàn)膠原數(shù)量明顯增多，膠原纖維平行皮膚表面，細(xì)胞數(shù)目(165±13個(gè)/區(qū)域)較前明顯較少(P0.5)；牽引后60 d；瘢痕部位細(xì)胞數(shù)目及膠原含量接近正常皮膚(73±11個(gè)/區(qū)域vs 80±10個(gè)/區(qū)域，P0.5)(0.95±0.09 vs 1±0.01，P0.5)(圖6)。

3 討論

由于對(duì)增生性瘢痕纖維增殖過(guò)程的病理機(jī)制尚不明了，目前的治療效果不理想。大量證據(jù)表明，張力跟增生性瘢痕有著密切聯(lián)系[3]，我們?cè)谛∈笃つw創(chuàng)面愈合早期給予機(jī)械張力刺激，14 d的持續(xù)牽拉后發(fā)現(xiàn)，形成的瘢痕在外觀和組織學(xué)上都符合人增生性瘢痕的特征，且在其后的60 d中可持續(xù)維持增生性瘢痕特征。

正常小鼠的皮膚跟人類(lèi)皮膚解剖結(jié)構(gòu)相差甚遠(yuǎn)，其皮膚松弛，布滿毛發(fā)，創(chuàng)面形成后，皮下肉膜組織牽拉周?chē)つw向創(chuàng)面中央聚攏，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，且愈合后幾乎不留痕跡。因此，必須借助牽拉裝置對(duì)老鼠創(chuàng)周皮膚施加張力，才能模擬人類(lèi)皮膚的張力環(huán)境[6]，促使其形成瘢痕。給予張力刺激的時(shí)機(jī)是決定瘢痕形成效果的重要因素，如果在創(chuàng)面未完全愈合時(shí)，也就是還處于炎癥早期給予張力，會(huì)影響創(chuàng)面愈合，只有在重新上皮化即炎癥期后期施加張力才會(huì)產(chǎn)生增生性瘢痕，并且持續(xù)牽拉時(shí)間必須達(dá)到7 d以上才可能形成增生性瘢痕[5]。在持續(xù)牽拉14 d后，我們通過(guò)HE及MASSON染色發(fā)現(xiàn)，形成的瘢痕為增生性瘢痕，瘢痕組織內(nèi)未見(jiàn)有明顯的毛囊及皮脂腺等皮膚附屬器，并且瘢痕組織明顯隆起于正常組織，色紅，質(zhì)硬，且其后的2個(gè)月中瘢痕組織依舊可以維持上述特征。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，瘢痕組織面積逐漸縮小，且被含有毛囊的新生組織占據(jù)。

哺乳動(dòng)物的毛囊作為復(fù)雜的微型器官，一直被認(rèn)為是不可再生的。但是，有研究認(rèn)為，兔子、小鼠皮膚在創(chuàng)傷后，毛囊有完全再生的能力[7]。因?yàn)槿狈ψ銐蜃C據(jù)，該觀點(diǎn)一直無(wú)法得到廣泛認(rèn)可。Ito等[8]研究發(fā)現(xiàn)，正常的成年小鼠毛囊缺失后可重新生成，再生的毛囊擁有正常毛囊干細(xì)胞，表達(dá)毛囊結(jié)構(gòu)分化標(biāo)志，并產(chǎn)生毛發(fā)，擁有毛囊正常的生長(zhǎng)周期。有研究證明，機(jī)體免疫作用是創(chuàng)面愈合過(guò)程中的重要因素，表皮γδT細(xì)胞可以分泌Fgf-7(成纖維生長(zhǎng)因子)、Fgf-10和IGF1(胰島素樣生長(zhǎng)因子)，對(duì)角化細(xì)胞的存活、增殖及遷移有著重要作用[9]。Gay等[10]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)降低Fgf-7表達(dá)時(shí)，會(huì)減少創(chuàng)面誘導(dǎo)的毛囊再生；相反，當(dāng)過(guò)表達(dá)Fgf-7時(shí)，新生毛囊則有2～3倍的增加，并且發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞分泌的Fgf－7可引發(fā)wnt的表達(dá)，增強(qiáng)了創(chuàng)面成纖維細(xì)胞wnt的活性，而激活的成纖維細(xì)胞也表達(dá)Fgf-7，放大了真皮損傷后的wnt信號(hào)，促進(jìn)皮膚毛囊的再生。但是，人類(lèi)皮膚真皮嚴(yán)重缺少定居γδT細(xì)胞，創(chuàng)傷后不能誘導(dǎo)毛囊再生。本實(shí)驗(yàn)中，小鼠的瘢痕組織面積縮小，被含有新生毛囊的正常組織替代，且接近于正常皮膚，驗(yàn)證了小鼠毛囊可以再生，同時(shí)表明毛囊的再生對(duì)小鼠的瘢痕修復(fù)有著重要作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)物模型在術(shù)后60 d內(nèi)可形成增生性瘢痕，且符合人增生性瘢痕特征；但因?yàn)閯?chuàng)面誘發(fā)毛囊再生，使得瘢痕組織面積縮小，不能長(zhǎng)期存在。

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