薛寶 劉鉞 劉坤 白玉川 俞峰 康新凱

（1.河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司，河南 南陽 473000；2.甘肅白銀賽諾生物科技有限公司，甘肅 白銀 730913）

一種酒精復(fù)合酶在酒精發(fā)酵中的應(yīng)用研究

薛寶1劉鉞1劉坤1白玉川2俞峰2康新凱1

（1.河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司，河南 南陽 473000；2.甘肅白銀賽諾生物科技有限公司，甘肅 白銀 730913）

本文闡述了一種新的酒精復(fù)合酶，這種酒精復(fù)合酶相對于酸性蛋白酶，可以更加充分地利用原料的特點(diǎn)以及各種酶的協(xié)同作用，使酒精用酶量大幅降低，減少用酶的成本，提高酒精產(chǎn)品的競爭力。研究表明添加量為0.3‰酸性蛋白酶與添加量為0.1‰酒精復(fù)合酶能夠取得一樣的效果，如果適當(dāng)延長發(fā)酵時(shí)間，酒精復(fù)合酶的添加成本相對酸性蛋白酶可以更低，添加量為0.1‰的酸性蛋白酶對酒精發(fā)酵的促進(jìn)效果要小于添加量為0.03‰的酒精復(fù)合酶對酒精發(fā)酵的促進(jìn)效果。研究結(jié)果為酒精生產(chǎn)提供了一種新的選擇。

酒精；酒精復(fù)合酶；酸性蛋白酶

在現(xiàn)代酒精發(fā)酵工藝中一般會(huì)加入酸性蛋白酶，這樣做可起到縮短發(fā)酵周期和提高原料出酒率的作用[1]，一般可提高原料出酒率1%～2%，提高發(fā)酵醪中酵母細(xì)胞數(shù)10%～30%，提高發(fā)酵速率，縮短發(fā)酵周期12 h～20 h[2]，主要原理是酸性蛋白酶對原料中的蛋白分解，使原料顆粒溶解，為淀粉酶的糖化作用創(chuàng)造了條件。但是在使用酸性蛋白酶的過程中也存在一些問題，比如如果加入的量比較大，額外的成本就會(huì)較高，降低了酒精產(chǎn)品的競爭力，而且發(fā)酵過程中由于酸性蛋白酶的作用會(huì)直接水解蛋白質(zhì)，如果酸性蛋白酶的質(zhì)量不好含有大量的雜菌，這樣就會(huì)影響發(fā)酵效果，甚至給生產(chǎn)造成損失[2]，因此需要考慮避免單一過度依靠酸性蛋白酶來改善酒精發(fā)酵的效果。

由于淀粉質(zhì)原料中除了含有淀粉顆粒外，還含有蛋白質(zhì)、纖維素、半纖維素、果膠和植酸等物質(zhì)，因此淀粉顆粒的釋放、液化、糖化過程可以是淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶等各種酶的協(xié)同作用的效果[3]。這種協(xié)同作用的作用機(jī)理是這種復(fù)合酶可以水解淀粉質(zhì)原料中的蛋白質(zhì)和纖維素等物質(zhì)，一方面可以破壞淀粉顆粒結(jié)構(gòu)，使其利于糖化作用，增加了可發(fā)酵性單糖，從而提高原酒出酒率；另一方面從原料中分解出更多可利用的氨基酸，促進(jìn)酵母生長發(fā)育、減輕酵母氨基酸合成代謝負(fù)荷的同時(shí)可以降低額外添加氮源的成本[4]，提高發(fā)酵速度，縮短發(fā)酵周期，同時(shí)由于原料中膠質(zhì)等成分的分解，降低了醪液的黏度，使得過濾速度明顯加快[5]。

本文闡述了一種酒精復(fù)合酶，這種酶在酸性蛋白酶的基礎(chǔ)上額外復(fù)配了其他類型的酶，使得在酒精發(fā)酵工藝中酶的添加量大幅度降低，而所起到的作用能夠達(dá)到至少相當(dāng)?shù)某潭?，有效地降低了用酶的成本，大幅度提高了酒精產(chǎn)品的競爭力。

1 材料與方法

1.1 主要原輔材料

1.1.1 原料：玉米粉，淀粉含量68%，市售。

1.1.2 酶制劑：糖化酶15萬u／mL，甘肅白銀賽諾生物科技有限公司；耐高溫α-淀粉酶2萬u／mL，甘肅白銀賽諾生物科技有限公司；酸性蛋白酶5萬u／mL，甘肅白銀賽諾生物科技有限公司；酒精復(fù)合酶，甘肅白銀賽諾生物科技有限公司。

1.1.3 菌種：耐高溫活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取玉米原料50 g，置于250mL三角瓶中，加水130 mL，耐高溫α-淀粉酶10 u／g淀粉，沸水浴下維持1h液化，冷卻醪液至30℃左右加入糖化酶200 u／g淀粉和1‰活性干酵母，置于32℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)60～70 h，發(fā)酵結(jié)束。

其中酸性蛋白酶和酒精復(fù)合酶與糖化酶一起加入。

1.3 分析方法

1.3.1 酒度與淀粉利用率

取100mL成熟發(fā)酵醪移入蒸餾瓶中，再用100mL蒸餾水，蒸餾接餾出液100mL，用酒精計(jì)和溫度計(jì)同時(shí)測定酒精度和溫度，并查表換算成20℃時(shí)的酒精度。

測定發(fā)酵成熟醪的殘總糖含量D（%，g／100g）和發(fā)酵成熟醪的重量G（g）

1-（D×G）／（100×1.1×50×0.68）式中：50-原料重量，g 0.68-原料淀粉含量

1.1-淀粉與糖的換算系數(shù)

1.3.2 還原糖和總糖

取成熟發(fā)酵醪液用濾紙過濾，吸取上清液用DNS法測定還原糖；總糖則先取10 g成熟發(fā)酵醪樣品，加入三角瓶，同時(shí)加入30mL 6mol／L鹽酸和100mL蒸餾水，沸水浴水解2 h，中和至中性定容于250mL容量瓶，過濾取上清液用DNS法測定總糖[6]。

1.3.3 總糖中單糖組分的測定HPLC

2 結(jié)果與分析

2.1酒用酸性蛋白酶不同添加量的酒精發(fā)酵試驗(yàn)

在發(fā)酵開始前添加不同量的酸性蛋白酶，試驗(yàn)結(jié)果見表1，表中數(shù)據(jù)是平行樣的平均值（下同）。

表 1 酒用酸性蛋白酶不同添加量的酒精發(fā)酵試驗(yàn)

從結(jié)果來看，不添加酸性蛋白酶的樣品與添加0.03‰酸性蛋白酶的樣品發(fā)酵結(jié)果相比，淀粉利用率和殘總糖都相差不大，其發(fā)酵效果相當(dāng)；添加0.06‰酸性蛋白酶的樣品與添加0.03‰酸性蛋白酶的樣品發(fā)酵結(jié)果相比，其淀粉利用率提高了8.81%，殘總糖下降16.6%，而且相對于0.03‰的添加量發(fā)酵結(jié)束時(shí)間提前了9小時(shí)，提高了發(fā)酵的效率和原料的利用率；酸性蛋白酶添加量達(dá)到0.09‰，與添加量為0.06‰酸性蛋白酶的樣品比，淀粉利用率和殘總糖都相當(dāng)，只是發(fā)酵結(jié)束時(shí)間又提前了5小時(shí)。

2.2 酒精復(fù)合酶不同添加量的酒精發(fā)酵試驗(yàn)

同2.1一樣在發(fā)酵前加入不同量的酒精復(fù)合酶，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表 2 酒精復(fù)合酶不同添加量的酒精發(fā)酵試驗(yàn)

從結(jié)果來看，添加了復(fù)合酶的樣品與不添加復(fù)合酶的樣品比，發(fā)酵結(jié)果均提高了淀粉利用率和降低了殘總糖，但是從添加復(fù)合酶的幾個(gè)樣品來看，幾個(gè)樣品在淀粉利用率與殘總糖的發(fā)酵數(shù)據(jù)相當(dāng)，只是發(fā)酵結(jié)束的時(shí)間和添加量的多少有一定的關(guān)系，0.03‰復(fù)合酶添加量的樣品相對于不添加復(fù)合酶的樣品發(fā)酵結(jié)束時(shí)間提前了15小時(shí)，0.06‰復(fù)合酶添加量的樣品相對于0.03‰復(fù)合酶添加量的樣品發(fā)酵結(jié)束時(shí)間又提前了5小時(shí)，0.09‰復(fù)合酶添加量的樣品相對于0.06‰復(fù)合酶添加量的樣品發(fā)酵結(jié)束時(shí)間提前了4小時(shí)。

2.3 酸性蛋白酶和酒精復(fù)合酶酒精發(fā)酵曲線對比試驗(yàn)

2.3.1 0.3‰酸性蛋白酶添加量與0.1‰酒精復(fù)合酶添加量酒精發(fā)酵曲線對比試驗(yàn)

對兩種酶的添加對比發(fā)酵曲線進(jìn)行跟蹤，測定失重、酒度和殘總糖中的葡萄糖，以此判斷兩者之間的對酒精發(fā)酵的促進(jìn)效果的對比，試驗(yàn)結(jié)果見下圖。

從酒度、失重和殘總糖中葡萄糖的跟蹤測定的結(jié)果看，這兩個(gè)樣品的發(fā)酵情況相當(dāng)，而且均在47-51小時(shí)內(nèi)基本結(jié)束發(fā)酵，因此在要求發(fā)酵結(jié)束時(shí)間為50小時(shí)左右時(shí)，酒精復(fù)合酶的添加量是酸性蛋白酶添加量的三分之一，大幅降低了用酶的成本。

2.3.2 0.1‰酸性蛋白酶添加量和0.03‰酒精復(fù)合酶添加量酒精發(fā)酵曲線對比試驗(yàn)

由于酒精復(fù)合酶對酒精發(fā)酵效果的影響相對于酸性蛋白酶而言更有邊際遞減效應(yīng)，因此如果要求的發(fā)酵結(jié)束時(shí)間適當(dāng)延長，更能體現(xiàn)酒精復(fù)合酶的添加效果。

對0.03‰酒精復(fù)合酶添加量與0.1‰酸性蛋白酶添加量進(jìn)行對比發(fā)酵曲線跟蹤測定，測定失重、酒度和殘總糖中的葡萄糖，以此判斷兩者之間的對酒精發(fā)酵的效果的對比，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

從圖中可以看出，添加了0.03‰酒精復(fù)合酶的酒精發(fā)酵的效率要高于添加了0.1‰酸性蛋白酶的酒精發(fā)酵效率。

圖 1 0.3‰酸性蛋白酶添加量與0.1‰酒精復(fù)合酶添加量酒精發(fā)酵曲線對比

圖 2 0.1‰酸性蛋白酶添加量和0.03‰酒精復(fù)合酶添加量酒精發(fā)酵曲線對比

3 結(jié)論

3.1 在以玉米為原料的酒精發(fā)酵工藝中適當(dāng)添加酸性蛋白酶和酒精復(fù)合酶可以提高發(fā)酵效率，縮短發(fā)酵時(shí)間。

3.2 酒精復(fù)合酶的添加對酒精發(fā)酵的促進(jìn)效果相較于酸性蛋白酶的添加效果而言更加具有邊際遞減效應(yīng)。

3.3 0.3‰酸性蛋白酶添加量的酒精發(fā)酵效率與0.1‰酒精復(fù)合酶添加量的酒精發(fā)酵相當(dāng)，而0.1‰酸性蛋白酶添加量的酒精發(fā)酵效率比0.03‰酒精復(fù)合酶添加量酒精發(fā)酵效率低。

3.4 與酸性蛋白酶效率相比，酒精復(fù)合酶的添加量更低，有效地降低了酒精發(fā)酵的用酶成本，提高了酒精產(chǎn)品的競爭力。

[1]肖冬華、趙華等.酒用酸性蛋白酶在酒精生產(chǎn)中應(yīng)用技術(shù)的研究[J].釀酒科技，2000（3）：35-38.

[2]王彥榮、孟祥春等.酸性蛋白酶生產(chǎn)與應(yīng)用的研究[J].釀酒，2003（3）：16-18.

[3]周恒剛.酸性蛋白酶在釀酒上的功能[J].釀酒科技，1998（6）：15.

[4]蔣錫瑞等.酶制劑應(yīng)用技術(shù)問答[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2008.130-132.

[5]李樹俊.酒用復(fù)合酶在酒精生產(chǎn)中的使用[J].釀酒，2011（2）.

[6]蔡定域.釀酒工業(yè)分析手冊[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，198.

TS262

A

1671-0037（2014）04-70-2

薛寶（1981-），男，本科，助理工程師，研究方向：燃料乙醇的生產(chǎn)和技術(shù)研究，生物能源發(fā)酵工藝及技術(shù)裝備。