霍建新，趙文博，白彩艷，趙征，*

（1.晉中學(xué)院，山西晉中030600；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

乳清蛋白的乳糖、脂肪和膽固醇含量低，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。乳清蛋白抗癌、增加骨密度、降低膽固醇含量。特別是干酪乳清在堿性蛋白酶的作用下，能產(chǎn)生具有抗氧化性活性肽[1-3]?？寡趸木哂星宄w內(nèi)過(guò)剩的活性氧自由基，保護(hù)線粒體和細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)與功能，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化[3]。因此，乳清蛋白的醫(yī)療保健作用日益受到注目，國(guó)內(nèi)對(duì)干酪乳清酶解物的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)處于起步階段。本研究探討酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠的血清與肝臟中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和丙二醛的含量等抗氧化活性指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 干酪乳清酶解產(chǎn)物的制備

新鮮干酪乳清（天津科技大學(xué)干酪科學(xué)與工程研究室提供），經(jīng)90℃，5 min的預(yù)處理后，在pH9.0、反應(yīng)溫度50℃、酶底物比0.04，分別加入Alcalase2.4 L堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解2.0 h，得到兩種干酪乳清酶解液，放于4℃冰箱備用。

1.2 動(dòng)物與分組

昆明種小鼠100只（中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重（18 g～22 g）。隨機(jī)分為5組，每組20只，雌雄各半。每籠10只喂養(yǎng)，喂指定飼料，自由進(jìn)食、飲水，保持環(huán)境溫度（20±1）℃，相對(duì)濕度（60±5）%。A組每天皮下注射生理鹽水，其他組皮下注射50 mg/mL D-半乳糖，均在頸背部。實(shí)驗(yàn)期為45 d，建衰老模型。小鼠適應(yīng)10 d后，開始樣品的測(cè)試，A、B、C、D、E組分別灌胃生理鹽水、生理鹽水、乳清、木瓜蛋白酶解液、堿性蛋白酶解液。每天灌胃1次，劑量為0.3 mL，測(cè)試期為45 d。

1.3 小鼠的抗氧化活性指標(biāo)的測(cè)量方法

試驗(yàn)?zāi)┢冢簞?dòng)物禁食12 h后稱重，摘取眼球取血，在4℃，3 000 r/min條件下離心20 min，離心分離血清，-70℃貯藏備用；頸椎脫臼法處死，開胸迅速摘下肝臟,預(yù)冷的PBS灌洗,濾紙吸干,稱重,-20℃凍藏待用。取肝0.3 g制備肝臟勻漿，生物組織勻漿機(jī)得到濃度為10%勻漿，在4℃，3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.1 小鼠肝臟與血清中超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定

SOD活力測(cè)定用黃嘌呤氧化酶法。超氧陰離子自由基由黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生，然后氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的存在下，表現(xiàn)為紫紅色，吸光度用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定。當(dāng)樣品中存在SOD時(shí)，抑制超氧陰離子自由基的產(chǎn)生，減少亞硝酸鹽形成，測(cè)定時(shí)樣品管的吸光度值低于對(duì)照管的吸光度值，通過(guò)公式計(jì)算，樣品中的SOD活力計(jì)算可得。采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定，SOD測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.3.2 小鼠肝臟與血清中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPX）的測(cè)定

在谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GSH-PX）的作用下，還原型谷胱甘肽（GSH）與過(guò)氧化氫（H2O2）反應(yīng)生成氧化性谷胱甘肽（GSSG）和H2O。用谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活力用酶促反應(yīng)的速度來(lái)表示，通過(guò)酶促反應(yīng)中還原型谷胱甘肽的含量變化的測(cè)定，酶的活力可計(jì)算。

GSH-PX的活力用催化GSH的反應(yīng)速度表示，由于GSH和H2O2在沒(méi)有酶的作用下，也能進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，稱為非酶促反應(yīng)，所以酶活力計(jì)算時(shí)必須扣除非酶促反應(yīng)使的GSH減少的量。

GSH量的測(cè)定：GSH和二硫代二硝基苯甲酸反應(yīng)生成5-硫代二硝基苯甲酸陰離子，此種物質(zhì)表現(xiàn)為黃色，且穩(wěn)定，然后在波長(zhǎng)為412 nm處測(cè)其吸光度，GSH的量可得。采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定，GSH-PX測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.3.3 小鼠肝臟與血清中丙二醛（MDA）的測(cè)定

過(guò)氧化脂質(zhì)降解生成丙二醛，丙二醛（MDA）與硫代巴比妥酸（TBA）發(fā)生縮合反應(yīng)，紅色物質(zhì)產(chǎn)生，此物質(zhì)在波長(zhǎng)為532 nm處有最大吸收峰。采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定，MDA測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用SPSS 11.5軟件進(jìn)行方差分析和LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 干酪乳清酶解物對(duì)小鼠血清與肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）的影響

干酪乳清酶解物對(duì)小鼠血清與肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）的影響，見(jiàn)表1。

表1 干酪乳清酶解物對(duì)小鼠血清與肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）的影響Table 1 Effects of whey hydrolysates on SOD in mice（±s，n=10）

表1 干酪乳清酶解物對(duì)小鼠血清與肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）的影響Table 1 Effects of whey hydrolysates on SOD in mice（±s，n=10）

注：A）假衰老組；B）對(duì)照組；C）干酪乳清組；D）木瓜蛋白酶乳清水解液；E）堿性蛋白酶乳清水解液；同列數(shù)據(jù)相同字母上標(biāo)表示差異不顯著（P＞5%）。

分組 肝臟SOD 血清SOD雌性 雄性 雌性 雄性A 74.53±44.84ab87.34±24.80a140.04±22.43a139.83±21.31ab B 55.96±40.18bc 20.90±7.06b 84.14±21.73b 113.43±50.25b C 15.91±5.54c 30.94±8.38b 150.73±9.62a 122.06±11.23ab D 109.52±7.06a 93.79±7.72a 146.00±4.01a 147.33±6.89ab E 94.18±1.43ab 83.48±5.77a 151.03±26.60a162.02±13.16a

木瓜蛋白酶水解干酪乳清組的雌性鼠和雄性鼠的肝臟中SOD含量與假衰老組無(wú)顯著性差異（p＞0.05），與對(duì)照組的含量有顯著性差異（p＜0.05），與乳清組也有顯著性差異（p＜0.05）。堿性蛋白酶水解干酪乳清組的雌性鼠和雄性鼠的肝臟中SOD含量與假衰老組無(wú)顯著性差異（p＞0.05），與對(duì)照組的雄性鼠有顯著性差異（p＜0.05），雌性鼠無(wú)顯著性差異（p＞0.05），與乳清組有顯著性差異（p＜0.05）。

木瓜蛋白酶組、堿性蛋白酶的雌性組血清中的SOD含量分別與對(duì)照組有顯著性差異（p＜0.05），與假衰老組與乳清組無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。堿性蛋白酶雄性組與對(duì)照組有顯著性差異，與其他組差異不顯著。

因此，乳清的木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶水解液可以提高小鼠肝臟和血清中的SOD的含量，與假衰老組相比，差異不顯著。

2.2 干酪乳清酶解物對(duì)小鼠血清與肝臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）的影響

干酪乳清酶解物對(duì)小鼠血清與肝臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）的影響，見(jiàn)表2。

表2 干酪乳清酶解物對(duì)小鼠血清與肝臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）的影響Table 2 Effects of whey hydrolysates on GSH-PX in mice（±s，n=10）

表2 干酪乳清酶解物對(duì)小鼠血清與肝臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）的影響Table 2 Effects of whey hydrolysates on GSH-PX in mice（±s，n=10）

注：A）假衰老組；B）對(duì)照組；C）干酪乳清組；D）木瓜蛋白酶乳清水解液；E）堿性蛋白酶乳清水解液；同列數(shù)據(jù)相同字母上標(biāo)表示差異不顯著（P＞5%）。

分組 肝臟GSH-PX 血清GSH-PX雌性 雄性 雌性 雄性A 94.60±14.87b227.69±65.99b124.96±30.82b110.93±9.15b B 96.22±69.86b202.86±59.22b 121.71±6.06b146.51±27.41b C 93.92±37.59b302.77±155.28b124.80±32.52b112.40±1.34b D 251.20±49.84a112.16±39.91b295.35±111.26ab358.14±71.60a E 248.19±67.31a909.42±573.28a516.28±247.75a365.89±75.94a

堿性蛋白酶組肝臟中的GSH-PX含量與假衰老組、對(duì)照組、乳清組有顯著性差異（p＜0.05），與木瓜酶雌性組無(wú)顯著性差異（p＞0.05）、雄性組有顯著性差異（p＜0.05）。堿性蛋白酶組血清中的GSH-PX含量與假衰老組、對(duì)照組、乳清組有顯著性差異（p＜0.05），與木瓜酶組差異性不顯著（p＞0.05）。

因此，乳清的堿性蛋白酶水解液可以提高小鼠肝臟和血清中的GSH-PX的含量，有顯著性差異。

2.3 干酪乳清酶解物對(duì)小鼠血清與肝臟中丙二醛（MDA）的影響

干酪乳清酶解物對(duì)小鼠血清與肝臟中丙二醛（MDA）的影響，見(jiàn)表3。

表3 干酪乳清酶解物對(duì)小鼠血清與肝臟中丙二醛（MDA）的影響Table 3 Effects of whey hydrolysates on MDA in mice（±s，n=10）

表3 干酪乳清酶解物對(duì)小鼠血清與肝臟中丙二醛（MDA）的影響Table 3 Effects of whey hydrolysates on MDA in mice（±s，n=10）

注：A）假衰老組；B）對(duì)照組；C）干酪乳清組；D）木瓜蛋白酶乳清水解液；E）堿性蛋白酶乳清水解液；同列數(shù)據(jù)相同字母上標(biāo)表示差異不顯著（P＞5%）。

肝臟MDA 血清MDA分組雌性 雄性 雌性 雄性A 11.40±5.31c 22.87±7.77a 9.23±1.27a 9.65±1.10a B 36.88±5.37a 20.84±9.35a 9.16±1.50a 9.04±0.92a C 31.10±0.97ab 18.64±4.61a 10.84±1.13a 9.08±0.94a D 27.45±2.01b 14.03±3.54a 8.70±0.85a 8.66±1.91a E 7.57±2.20c 12.53±5.95a 9.08±1.29a 8.70±1.03a

堿性蛋白酶雌性組小鼠肝臟中的MDA含量與對(duì)照組、乳清組和木瓜酶組小鼠肝臟中的MDA含量都有顯著性差異（p＜0.05），與假衰老組小鼠肝臟中的MDA含量無(wú)顯著性差異（p＞0.05），而堿性蛋白酶解液小鼠雄性組肝臟中的MDA含量與其它組均無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。堿性蛋白酶組血清中的MDA含量與其它組均無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。因此，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶水解乳清的產(chǎn)物對(duì)雄性小鼠的肝臟和心清中的MDA含量無(wú)顯著性影響。

3 討論

GSH-PX的活力作為衡量機(jī)體抗氧化性水平的一項(xiàng)生化指標(biāo)[4-5]。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的催化過(guò)氧化氫分解一種重要的酶。還原型谷胱甘肽（GSH）對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)需要GSH-PX催化，具有保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、功能完整的作用。本實(shí)驗(yàn)干酪乳清酶解液對(duì)小鼠的肝臟和血清中的GSH-PX含量有顯著的影響，它的抗氧化效果是由GSH-PX來(lái)調(diào)解的，但不能排除酶的種類和酶解條件的影響，應(yīng)進(jìn)行干酷乳清的酶解的優(yōu)化研究。經(jīng)90℃，5 min的預(yù)處理后，在pH9.0、反應(yīng)溫度50℃、酶底物比0.04，水解2.0 h，Alcalase2.4 L堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解度最高。另外，在測(cè)定小鼠抗氧化性的實(shí)驗(yàn)中，血清中三項(xiàng)指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定，得到的數(shù)據(jù)不能準(zhǔn)確反應(yīng)樣品的藥物短期能力，所以，這個(gè)問(wèn)題應(yīng)該通過(guò)定期對(duì)小鼠血清測(cè)定，使用靜脈埋管取血來(lái)克服。

SOD清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用[6-7]。MDA的量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，細(xì)胞損傷的程度可間接的反映[8]。

MDA的測(cè)定常常與SOD的測(cè)定相互配合，SOD活力的高低反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA含量的高低反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，通過(guò)SOD活力與MDA含量的分析，有助于動(dòng)物體內(nèi)抗氧化性的研究。本實(shí)驗(yàn)使用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶Alaclase 2.4L，將干酪乳清中的酪蛋白、白蛋白分解產(chǎn)生具有較強(qiáng)抗氧化作用的多肽。本實(shí)驗(yàn)中木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶水解乳清后的得到的產(chǎn)物可以提高小鼠肝臟和血清中的SOD的含量，與假衰老組的無(wú)顯著性差異，可能是干酪乳清中含有較多蛋白肽，具有阻礙抗氧化的功能[5-7]。木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶水解乳清的產(chǎn)物對(duì)雄性小鼠的肝臟和心清中的MDA含量無(wú)顯著性影響，表明干酪乳清酶解液不能顯著降低MDA含量，這一結(jié)果還需臨床觀察進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

研究干酪乳清酶解液對(duì)小鼠抗氧化活性的影響。干酪乳清的木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶水解液可以提高小鼠肝臟和血清中的SOD的含量，與假衰老組差異不顯著。乳清的堿性蛋白酶水解產(chǎn)物提高小鼠肝臟和血清中的GSH-PX的含量，差異性顯著。乳清的木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶水解產(chǎn)物對(duì)雄性小鼠的肝臟和血清中MDA含量影響不著性。用干酪乳清酶解產(chǎn)物喂養(yǎng)小鼠，能明顯增強(qiáng)抗氧化活性，效果明顯優(yōu)于乳清。

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