李海平，陳冬梅，吳蓉蓉，王迎進(jìn)

（忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州034000）

壺瓶棗（Zizyphusjujuba cv.Huping）為鼠李科（Rhamnaceae）棗屬植物果實(shí)。壺瓶棗個(gè)大、皮簿、肉厚，風(fēng)味甘美，有“八個(gè)一尺，十個(gè)一斤”之美稱，在國內(nèi)外享有盛譽(yù)，主要產(chǎn)于山西太谷、榆次、交城、清徐等地。壺瓶棗是一種滋補(bǔ)佳品，中醫(yī)認(rèn)為有補(bǔ)中益氣，養(yǎng)血安神，生津液，潤心肺，補(bǔ)五臟，治虛損及解毒等功效，在產(chǎn)區(qū)有“每日三顆壺瓶棗，身體強(qiáng)健不服老”的說法。近年來，國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道了對(duì)壺瓶棗的初步研究，多集中在壺瓶棗的防裂、栽培及儲(chǔ)藏技術(shù)[1-2]；另外，侯天宇研究了壺瓶棗中蘆丁的超聲波法提取工藝[3]；王愈研究了壺瓶棗汁浸提和澄清工藝[4]；而關(guān)于壺瓶棗提取抗氧化性的相關(guān)研究卻鮮見報(bào)道。鑒于壺瓶棗藥食兩用的對(duì)重功效，本實(shí)驗(yàn)探討了壺瓶棗提取物的抗氧化性，為進(jìn)一步揭示壺瓶棗的生物活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壺瓶棗：購于山西忻州農(nóng)貿(mào)市場；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、菲洛嗪、DPPH：購于Sigma公司，其他試劑，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 壺瓶棗的提取

將壺瓶棗去核，干燥，粉碎，過60目篩。取50 g置于圓底燒瓶中加入500 mL乙醚，回流提取2 h以脫脂，抽濾，然后再加入500 mL石油醚，回流提取2 h脫色，抽濾。濾渣通風(fēng)干燥得壺瓶棗棗粉。

水提取物：稱取脫脂脫色壺瓶棗粉5 g，料液比為1∶20（g/mL），在溫度60℃、功率240 W條件下超聲30 min，取上清液。同樣方法重復(fù)提取一次，合并濾液得壺瓶棗水提取物。

醇提取物：以無水乙醇代替二次蒸餾水按上述方法得醇提取物。

1.2.2 提取物的定性實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 顯色反應(yīng)

取0.01 g/mL FeCl3溶液，向待測液中滴加該溶液，觀察顏色變化。配制0.02 g/mL FeCl3溶液和0.01 g/mL鐵氰化鉀溶液，等體積混合，向待測液中滴加該溶液，觀察顏色變化；加入HCl溶液，觀察顏色變化。配制0.01 g/mL AlCl3溶液，向待測液中滴加該溶液，觀察顏色變化[5]。

1.2.2.2 提取物黃酮類化合物含量的測定

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品11.7 mg，用70%的乙醇定容至 50 mL 容量瓶中。分別取 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于8個(gè)10 mL比色管中，用70%乙醇補(bǔ)充至 5 mL，加入 0.3 mL 0.05 g/mL NaNO2，搖勻，放置6 min后加入0.3 mL 0.1g/mL Al（NO3）3，搖勻，6 min后加入4 mL 0.04 g/mL的NaOH，混勻，用70%乙醇定容，10 min后于510 nm波長處測定吸光度（A）值。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.011 3x+0.004 5（R2=0.997 1）。

1.2.3 壺瓶棗提取物的抗氧化性

1.2.3.1 羥自由基清除率的測定參考文獻(xiàn)[6]

量取2.0 mLPBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.4，下同）和4.0 mL蒸餾水于10 mL比色管中，定容作空白參比管；量取 2.0 mLPBS，1.0 mL 鄰二氮菲（1.5 mmol/L，下同）、1.0 mLFeSO4（1.5 mmol/L，下同）和 2.0 mL蒸餾水于10 mL比色管中，混勻作未損傷管；量取2.0mL PBS，1.0 mL 鄰二氮菲，1.0 mL FeSO4，1.0 mL 蒸餾水和1.0 mL H2O2（0.02%）于 10 mL 比色管中，作損傷管；量取2.0 mLPBS，1.0 mL樣品液和3.0 mL蒸餾水于10 mL比色管中，作樣品參比管；量取2.0 mLPBS，1.0 mL鄰二氮菲，1.0 mLFeSO4，1.0 mL壺瓶棗試樣液和1.0 mL H2O2于10 mL比色管中，定容作樣品管。將上述試管置于恒溫水浴鍋中，37℃保溫60 min，于波長536 nm處測吸光度（A）值，每種處理平行3次，用其平均值按下式計(jì)算羥自由基清除率（%）。以VC作對(duì)照。

1.2.3.2 超氧陰離子自由基清除率的測定參考文獻(xiàn)[7]

采用鄰苯三酚自氧化法，量取Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL向其中加入1.0 mL鄰苯三酚（7 mmol/L）并開始計(jì)時(shí)，定容到10 mL，于325 nm處測得反應(yīng)體系的吸光值A(chǔ)0。按照上述方法，量取4.5 mLTris-HCl緩沖溶液和1 mL藥液，在室溫下放置4 min，立即加入1 mL鄰苯三酚并開始計(jì)時(shí)，定容到10 mL，于325 nm處每隔30 s測定反應(yīng)體系的吸光值A(chǔ)i，共記錄前4 min；實(shí)驗(yàn)平行3次，求其平均值。按下式計(jì)算超氧陰離子自由基清除率（%）。以VC作對(duì)照。

1.2.3.3 DPPH·清除率的測定參考文獻(xiàn)[8]

量取2.0 mL藥液及2.0 mL濃度為2×10-4mol/L的DPPH·溶液于10 mL比色管，30 min后以試樣提取溶劑為空白調(diào)零于517 nm處測定其吸光度Ai；測定2.0 mL濃度為2×10-4mol/L的DPPH·溶液與2.0 mL 70%乙醇混合液的吸光度Ac；再測定2 mL壺瓶棗提取液與2.0 mL無水乙醇混合液的吸光度Aj；平行測定3次，求其平均值。根據(jù)下列公式計(jì)算壺瓶棗提取液對(duì)DPPH·的抑制率（%）。以VC作對(duì)照。

1.2.3.4 還原性測定參考文獻(xiàn)[9]

移取壺瓶棗提取物，稀釋成一定濃度的溶液，取1 mL不同濃度梯度的各樣品，加入2.5 mL 0.01 g/mL K3Fe（CN）6，2.5 mL 0.2 mol/L，pH=6.6 的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻，于50℃反應(yīng)20 min。取出再加入2.5 mL 0.1 g/mL三氯乙酸。離心10 min，取上層溶液5.0 mL加入蒸餾水5.0 mL，0.1 g/100 mL FeCl31.0 mL，用分光光度計(jì)于700 nm波長處測定吸光度。

1.2.3.5 金屬螯合能力的測定參考文獻(xiàn)[10]

取不同濃度的樣品溶液1.0 mL于試管中，分別加入0.05 mL 2 mmol/L的FeCl2溶液、0.2 mL 5 mmol/L的菲洛嗪溶液和2.75mL蒸餾水，混勻，10min后于562nm波長處測定吸光度。同時(shí)做樣品空白實(shí)驗(yàn)（以水代替FeCl2溶液）。以水代替樣液和FeCl2溶液，做參比實(shí)驗(yàn)調(diào)零。所有測定值均為3次平均值?；旌象w系中Ferrozine-Fe2+抑制率計(jì)算如下。

式中：A0為水代替樣液時(shí)的吸光度值；A1為樣品的吸光度值；A2為樣品空白的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色反應(yīng)

壺瓶棗提取物的顯色實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 壺瓶棗提取物顯色反應(yīng)Table 1 Phenomena of color reaction for extracts from Zizyphus jujube cv.Huping

由表1可知，特定顏色反應(yīng)表明壺瓶棗水提取物和乙醇提取物中均含有黃酮類化合物。

2.2 壺瓶棗提取物中黃酮類化合物含量測定

壺瓶棗水提物中黃酮類物質(zhì)含量為2.86 mg/g，醇提物黃酮類物質(zhì)含量為6.57 mg/g。

2.3 對(duì)羥自由基清除率的測定

羥自由基清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標(biāo)。壺瓶棗提取物和VC對(duì)羥自由基的清除效果見圖1。

由圖1可知，在較低濃度范圍內(nèi)，壺瓶棗提取物就具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力，且隨著質(zhì)量濃度的增大，其羥自由基清除能力也隨之增強(qiáng)。壺瓶棗提取物清除羥自由基能力為：壺瓶棗乙醇提取物IC50為60.03 μg/mL，水提取物 IC50為 61.04 μg/mL，稍高于 VC 70.31 μg/mL。

圖1 壺瓶棗提取物對(duì)HO·的清除作用Fig.1 The HO·scavenging capacity of extracts from Zizyphus jujube cv.Huping

2.4 對(duì)超氧陰離子自由基清除率的測定

壺瓶棗提取物和VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果見圖2。

圖2 壺瓶棗提取物對(duì)O2-·自由基的清除作用Fig.2 The O2-·scavenging capacity of extracts from Zizyphus jujube cv.Huping

由圖2可知，壺瓶棗提取物清除超氧陰離子自由基能力高于VC（IC5022.03 μg/mL），且隨著質(zhì)量濃度的增大，對(duì)超氧陰離子自由基清除能力也隨之增強(qiáng)。壺瓶棗水提取物IC50為1.80 μg/mL，乙醇提取物IC50為1.70 μg/mL。

2.5 對(duì)DPPH·自由基清除率的測定

壺瓶棗提取物和VC對(duì)DPPH·的清除效果見圖3。

由圖3可知，壺瓶棗提取物對(duì)DPPH·的清除能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。壺瓶棗提取物對(duì)DPPH·自由基清除能力依次為：壺瓶棗乙醇提取物IC50為0.58μg/mL，壺瓶棗水提取物 IC50為 4.13 μg/mL，VC的IC50為 0.57 μg/mL。

2.6 還原性測定

物質(zhì)的還原能力可以看作其潛在抗氧化性的重要體現(xiàn)。壺瓶棗提取物和VC的還原能力效果見圖4。

圖3 壺瓶棗提取物對(duì)DPPH·的清除作用Fig.3 The DPPH·scavenging capacity of extracts from Zizyphus jujube cv.Huping

圖4 壺瓶棗提取物還原性測定Fig.4 The reducing power of extracts from Zizyphus jujube cv.Huping

由圖4可知，在較低濃度范圍內(nèi)，壺瓶棗提取物均表現(xiàn)出一定還原能力，且隨著濃度的增大，其還原能力也逐漸增強(qiáng)。壺瓶棗提取物的還原能力為：VC＞醇提取物＞水提取物。

2.7 金屬螯合能力測定

壺瓶棗提取物金屬螯合能力效果如圖5所示。

圖5 壺瓶棗提取物金屬螯合能力測定Fig.5 The ferrous iron chelating capacity of extracts from Zizyphus jujube cv.Huping

由圖5可知，壺瓶棗水提取物和醇提取物均具有金屬螯和能力，且金屬螯合能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。水提取物的IC50為426.02 μg/mL，而醇提取物的IC50為36.67 μg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于水提取物的金屬螯合能力。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)證明：壺瓶棗提取物均具有清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的能力及金屬螯合能力和還原能力。壺瓶棗水提取物的抗氧化能力為：超氧陰離子自由基（IC501.80 μg/mL）＞DPPH·自由基（IC504.13 μg/mL）＞羥自由基（IC5061.04 μg/mL）。而醇提取物的抗氧化能力為：DPPH·自由基（IC500.58 μg/mL）＞超氧陰離子自由基（IC501.70 μg/mL）＞羥自由基（IC5060.03 μg/mL）。醇提物的金屬螯合能力和還原能力均高于水提物。

[1]吳萍,田世平,徐勇.氣調(diào)貯藏對(duì)壺瓶棗果實(shí)細(xì)胞壁和角質(zhì)層成分及品質(zhì)的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(2):619-625

[2]孟玉平,孫海峰,曹秋芬,等.壺瓶棗花芽分化與落性枝生長發(fā)育觀察[J].果樹學(xué)報(bào),2009,26(4):487-491

[3]侯天宇,賴芳芳,孟凡欣.超聲波提取壺瓶棗中蘆丁的工藝研究[J].海南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2011,24(4):411-414

[4]王愈,張志勇.壺瓶棗汁浸提和澄清工藝參數(shù)的研究[J].食品科學(xué),2005,26(增刊):61-63

[5]呂麗爽,謝天飛,樊玉潔.馬蘭提取物抗氧化性研究[J].食品科學(xué),2010,31(13):122-125

[6]蔡仲軍,陳仕江,伊定華,等.不同產(chǎn)地冬蟲夏草清除羥基自由基作用的研究[J].中草藥,2004,35(1):57-59

[7]Huang W,Xue A,Niu H.Optimised ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Folium eucommiae and evaluation of antioxidant activity in multi-test systems in vitro[J].Food chemistry,2009,114(3):1147-1154

[8]Amarowicz R,Naczk M,Shahidi F.Antioxidant activity of various fractions of non-tannin phenolics of canola hulls[J].Journal of agricultural and food chemistry,2000,48(7):2755-2759

[9]Mau J L,HuangP N,Huang S J,et al.Antioxidant properties of methanolic extracts from two kinds of Antrodia camphorata mycelia[J].Food chemistry,2004,86：25-31

[10]祝子坪,李娜.桑黃菌多糖體外抗氧化作用[J].食品科學(xué)，2011,32(19):92-95