李利敏，楊萍，張冠洲，洪鵬志

（廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

羅非魚是淡水養(yǎng)殖業(yè)的重要養(yǎng)殖品種之一，也是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推廣養(yǎng)殖的種類之一[1]。目前全世界已有85個(gè)國(guó)家和地區(qū)養(yǎng)殖羅非魚，年產(chǎn)量約200多萬(wàn)t。2006年我國(guó)羅非魚產(chǎn)量超過(guò)100萬(wàn)t，占世界總產(chǎn)量的一半以上。廣東具備養(yǎng)殖羅非魚的得天獨(dú)厚的優(yōu)越條件，是我國(guó)養(yǎng)殖羅非魚最早、養(yǎng)殖面積最多和產(chǎn)量最高的地區(qū)。在冷凍羅非魚片的加工中，魚片利用率只占整條魚的40%左右，造成大量浪費(fèi)，還容易對(duì)環(huán)境造成污染，而羅非魚下腳料的主要成分是蛋白質(zhì)，其蛋白酶解液有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此對(duì)羅非魚加工下腳料的綜合利用，可以降低羅非魚的加工成本，提高羅非魚的利用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但是蛋白酶解液顏色較深、腥苦味較重，這給蛋白酶解液的應(yīng)用帶來(lái)了很大阻礙，如何解決這類問(wèn)題，成為羅非魚下腳料蛋白酶解液開發(fā)利用的關(guān)鍵問(wèn)題。活性炭具有良好的吸附脫色特性，是食品工業(yè)中廣泛使用的吸附澄清劑，已有關(guān)于活性炭對(duì)海洋蛋白酶解液脫腥脫色的研究[2-4]，但多以研究吸附工藝條件為主，少見有關(guān)于活性炭吸附對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的影響的研究報(bào)道。本文用活性炭吸附處理羅非魚下腳料蛋白酶解液，研究了吸附對(duì)脫色、蛋白質(zhì)損失以及風(fēng)味物質(zhì)的影響，以期為羅非魚下腳料蛋白酶解液的有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚下腳料：湛江市恒興水產(chǎn)科技有限公司提供，包括內(nèi)臟、魚頭和魚骨，去除內(nèi)臟清洗干凈，經(jīng)絞肉機(jī)絞碎分裝后，凍藏于實(shí)驗(yàn)室－18℃冷柜中備用。

活性炭（食品級(jí)Y-200）：長(zhǎng)葛市通達(dá)活性炭廠；蛋白酶：木瓜蛋白酶：酶活力65×104U/g，中性蛋白酶：酶活力20×104U/g，廣西南寧市龐博生物工程有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

離心機(jī)；pH計(jì)；722S型紫外可見分光光度計(jì)；恒溫水浴鍋；GC-MS；同時(shí)蒸餾萃取裝置等。

1.3 方法

1.3.1 酶解液的制備

羅非魚下腳料自然解凍后，料液比 1∶2，pH7.0，于55℃的恒溫水浴鍋中，先加入中性蛋白酶水解1 h，后加入木瓜蛋白酶繼續(xù)水解2 h（酶用量均為1 100 U/g原料），然后于90℃水浴滅酶10 min，冷卻后，8 000 r/min離心15 min，去除上層油脂與下層殘?jiān)?，中間層為酶解液。

1.3.2 吸附試驗(yàn)

酶解液中加入一定量的活性炭，在一定的pH、溫度下吸附一段時(shí)間后，4 500 r/min離心20 min去除活性炭，進(jìn)行脫色率、蛋白質(zhì)損失率的測(cè)定。

1.3.3 脫色率測(cè)定

酶解液吸附前后在400 nm處的吸光度分別為OD400nm、OD′400nm，脫色率表示為 DE400nm。每個(gè)樣品測(cè)定 3次取平均值。

脫色率DE400nm（%）=（吸附前OD400－吸附后OD400）/吸附前 OD400×100

1.3.4 蛋白質(zhì)損失率測(cè)定

酶解液在210 nm～220 nm有最大吸收峰，主要是由肽健產(chǎn)生的。測(cè)定酶解液吸附前后的吸光度OD220nm、OD′220nm，蛋白質(zhì)損失率表示為L(zhǎng)P220nm。每個(gè)樣品測(cè)定3次取平均值。

蛋白質(zhì)損失率LP220nm（%）=（吸附前OD220－吸附后OD220）/吸附前 OD220×100

1.3.5 同時(shí)蒸餾萃取

取吸附前后的酶解液各100 mL，乙醚各60 mL，分別裝在兩個(gè)萃取瓶中，用電熱套加熱，乙醚溫度為49℃，酶解液保持微沸狀態(tài)，連接同時(shí)蒸餾萃取裝置連續(xù)萃取2 h。收集乙醚萃取液，加入適量的無(wú)水硫酸鈉，放入冰箱冷凍24 h后，過(guò)濾，濃縮至1 mL左右，貯于-18℃冰箱中，以備GC-MS分析。

1.3.6 GC-MS分析

氣相色譜條件：色譜柱Rtx-5 ms石英毛細(xì)管柱30 m×0.25 μm×0.25 mm；升溫程序：起始溫度 50℃，保持2 min，然后以5℃/min的升溫速度升溫到300℃，再以10℃/min的升溫速度升溫到320℃；進(jìn)樣方式：手動(dòng)（不分流）；進(jìn)樣口溫度250℃；進(jìn)樣量1 μL；載氣為 He；載氣流量 1.58 mL/min；分流比 12∶1。

質(zhì)譜條件：離子源EI源；電子能量70 eV；離子源溫度為200℃；接口溫度為250℃。

1.3.7 分析方法

定性分析：把按以上步驟獲得的樣品置入GC-MS聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定，通過(guò)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)檢索同時(shí)與NIST譜庫(kù) （107k compounds）和 Wiley譜庫(kù)（320k Compounds，version 610）相匹配，僅列出匹配度大于80%的化合物，確認(rèn)化合物成分。

定量分析：通過(guò)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按照面積歸一化法進(jìn)行定量分析，分別求得各化學(xué)成分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸附適宜條件的確定

根據(jù)單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（未列出），以pH、活性炭用量、溫度、時(shí)間為變量，以脫色率和蛋白質(zhì)損失率為指標(biāo)，進(jìn)行U9（96）均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化吸附條件，選擇出最佳優(yōu)化方案，試驗(yàn)方案和結(jié)果見表1。

表1 U9（96）均勻試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 1 Even test plan and results

對(duì)表1的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行全回歸分析，獲得關(guān)于蛋白質(zhì)損失率（y1）、脫色率（y2）兩個(gè)回歸方程，蛋白質(zhì)損失率（y1）方程在 α=0.20水平上呈顯著，脫色率（y2）方程在α=0.15水平上呈顯著。兩個(gè)回歸方程在一定程度上可以解釋試驗(yàn)的結(jié)果。

本試驗(yàn)?zāi)康氖且竺撋试酱笤胶?，蛋白質(zhì)損失率越小越好，因此對(duì)兩個(gè)方程求其最大值或最小值時(shí)的最佳工藝條件，再綜合單因素水平影響分析，結(jié)果見表2。

表2 吸附的最佳工藝條件Table 2 Optimum parameters of adsorption

從表2可以看出，不同的試驗(yàn)指標(biāo)下最佳工藝條件是有所差異的，根據(jù)各工藝參數(shù)對(duì)結(jié)果的影響及綜合各指標(biāo)的重要程度，首先是損失率，其次為脫色率，因此選擇吸附的工藝條件為pH6.0、活性炭用量0.85%、溫度50℃和時(shí)間55 min。在此條件下的進(jìn)行模型預(yù)測(cè)和驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The testing results

從表3可以看出，蛋白質(zhì)損失率和脫色率的模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值時(shí)非常接近的，因此吸附的最佳工藝條件為pH6.0、活性炭用量0.85%、溫度50℃和時(shí)間55 min；在此條件下?lián)p失率為6.6%，脫色率為49.2%，且吸附后的酶解液與吸附前樣品相比，顏色呈淡黃色，色澤清澈，有輕微的魚腥味，苦味不明顯。

2.2 吸附對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的影響

羅非魚下腳料蛋白酶解液主要由氨基酸、小分子多肽和核苷酸等呈味物質(zhì)組成，其腥臭味來(lái)源于原料本身和水解過(guò)程，其形成的主要原因有[5]：（1）養(yǎng)殖環(huán)境的影響。魚飼料、水產(chǎn)動(dòng)物食用的藻類、水質(zhì)等條件對(duì)腥味物質(zhì)的形成都有一定作用。Suffet等[6]研究了水體中對(duì)魚腥味形成有作用的物質(zhì)，認(rèn)為主要有己醛（hexanal）、庚醛（heptanal）、反-2，順-4-癸二烯醛（trans，cis-2，4-Decadienal）、反-2，順-4，順-7 癸三烯醛 （2-trans，4-cis，7-cis-decatrienal）、反-4-庚醛（trans，4-Hept-enal）及 1-戊烯-3 酮（1-penten-3-one）等物質(zhì)。（2）在儲(chǔ)藏和處理的過(guò)程中，由于一些物理和機(jī)械作用，魚類體表會(huì)對(duì)體外的一些揮發(fā)性有機(jī)物化合物產(chǎn)生吸附，從而加重魚類本身固有的腥味。（3）魚類體中的物質(zhì)發(fā)生生化反應(yīng)，產(chǎn)生異味物質(zhì)，如體內(nèi)的脂肪酸自動(dòng)氧化，會(huì)產(chǎn)生一些腥臭物質(zhì)，一些多脂類魚在凍藏過(guò)程中會(huì)伴隨油燒的發(fā)生，使乙醛（ethanal）、丙醛（propanal）、丁醛（n-butylaldehyde）、戊醛（n-pentanal）等醛類顯著增加[7]，很多學(xué)者認(rèn)為脂質(zhì)氧化是造成魚類腥臭氣味加重的重要因素；魚表皮粘液和體內(nèi)含有各種蛋白質(zhì)，分解成肽和氨基酸后，在酶和微生物的作用下，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)脫羧和脫氨反應(yīng)生成有δ-氨基戊醛、δ-氨基戊酸和六羥基吡啶等腥味物質(zhì)。

GC-MS分析活性炭吸附前后酶解液風(fēng)味物質(zhì)結(jié)果見圖1、2 和表4、5。

圖1 羅非魚下腳料酶解液GC-MS總離子流圖譜（吸附前）Fig.1 Ion chromatograph of Tilapia scraps enzymatic hydrolysate by GC-MS（before adsorption）

圖2 羅非魚下腳料酶解液GC-MS總離子流圖譜（吸附后）Fig.2 Ion chromatograph of Tilapia scraps enzymatic hydrolysate by GC-MS（after adsorption）

從表4、5中可以看出，檢測(cè)到的風(fēng)味物質(zhì)主要包括酯類、醛類、酮類、醇類、酸類、胺類和一些雜環(huán)類等，其中含量較多的有酯類、醛類和醇類。吸附前檢測(cè)到的風(fēng)味物質(zhì)主要種類按照相對(duì)含量比例依次為醛類、酯類、醇類、酮類、胺類、酸類。相對(duì)含量較高的醛類、酯類、醇類分別達(dá)到33.27%、23.1%、9.51%；吸附后檢測(cè)到的風(fēng)味物質(zhì)主要種類按照相對(duì)含量比例依次為酯類、醛類、酮類、醇類、酸類、胺類。相對(duì)含量較高的酯類、醛類、酮類分別達(dá)到26.19%、16.35%、6.95%。

通過(guò)表4、5對(duì)比可知，吸附前后，各類物質(zhì)的相對(duì)含量均發(fā)生了變化。變化最為顯著的為醛類，吸附前后由33.27%降到16.35%，此外醇類由9.51%降到6.05%，胺類由3.76%降到2.03%；而酯類、酮類、酸類的相對(duì)含量都有提高，其中酯類由23.10%升到26.19%，酮類由4.26%升到6.95%，酸類由0.50%升到3.30%，因此可知活性炭對(duì)醇類、醛類和胺類的吸附能力較強(qiáng)。

表4 吸附前主要風(fēng)味物質(zhì)及含量Table 4 The main flavor substances and content before adsorption

表5 吸附后主要風(fēng)味物質(zhì)及含量Table 5 The main flavor substances and content after adsorption

綜合以上分析可知，羅非魚下腳料酶解液經(jīng)活性炭吸附后，影響腥味嚴(yán)重的醛類、酮類和胺類明顯減小，此外一些研究證明腥味物質(zhì)被吸附的同時(shí)一些苦味肽也被明顯吸附[8]，所以經(jīng)過(guò)活性炭吸附以后腥苦味降低。

3 結(jié)論

通過(guò)均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)對(duì)活性炭吸附羅非魚下腳料蛋白酶解液的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：在pH6.0、活性炭用量0.85%、溫度50℃、時(shí)間55 min的條件下吸附，蛋白質(zhì)損失率為6.6%，脫色率為49.2%；且吸附后的酶解液顏色呈淡黃色，色澤清澈，有輕微的魚腥味，苦味不明顯，影響腥味嚴(yán)重的醛類、酮類和胺類明顯減??；由此吸附以后的酶解液外觀澄清透明，腥苦味較弱，易于被人們接受，這為羅非魚下腳料蛋白的有效利用提供了重要的理論依據(jù)。

[1]邸剛.關(guān)于我國(guó)羅非魚產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的探討[J].中國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)，2002(4):17-18

[2]鄭桂富,徐振相.鰱魚蛋白水解液脫色效果的研究[J].食品工業(yè)科技,2002(9):25-27

[3]施文正,汪之和,林爭(zhēng)艷,等.白鰱魚蛋白水解液脫腥脫苦的研究[J].海洋水產(chǎn)研究,2004,25(3):28-32

[4]宋永相,孫謐,王海英,等.海洋活性膠原肽酶解液的脫色脫腥工藝[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2008,32(5):804-810

[5]王國(guó)超,李來(lái)好,郝淑賢,等.水產(chǎn)品腥味物質(zhì)形成機(jī)理及相關(guān)檢測(cè)分析技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2012,33(5):401-409

[6]Suffet I H,Khiari D,Bruchet A.The drinking water taste and odor wheel for the millennium：beyond geosmin and 2-methylisoborneol[J].Wat Sci Tech,1999,40(6):1-13

[7]沈月新,章超華,薛長(zhǎng)湖,等.水產(chǎn)食品學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2000：102-107

[8]楊蘭,白勇.蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物苦味的形成及脫除的研究[J].廣州食品工業(yè)科技,2002,18(2):22-25