黃學(xué)文，李素芝，黃 躍，謝曉餓，劉厚東，閆春城，石泉貴，丁浩平，何 鋒，陳 有

EPO單克隆抗體抑制CFU-E研究

黃學(xué)文，李素芝，黃 躍，謝曉餓，劉厚東，閆春城，石泉貴，丁浩平，何 鋒，陳 有

目的 探討EPO單克隆抗體是否具有抑制紅系集落形成單位(CFU-E)形成的功能。方法 對(duì)大鼠骨髓進(jìn)行定向體外CFU-E培養(yǎng)，按以下條件進(jìn)行分組培養(yǎng)：空白對(duì)照組(不加EPO)、常規(guī)組(加EPO，不加EPO單克隆抗體)、EPO單克隆抗體干預(yù)組(EPO+EPO單克隆抗體)。培養(yǎng)168 h后，觀察各組CFU-E數(shù)量。結(jié)果 空白對(duì)照組、常規(guī)組、EPO單克隆抗體干預(yù)組的CFU-E集數(shù)落分別為0.0±0.0、151.8±23.3和10.7±3.9。EPO單克隆抗體干預(yù)組與常規(guī)組比較，CFU-E集落數(shù)存在非常顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論 該EPO單克隆抗體可明顯抑制CFU-E形成，即抑制紅細(xì)胞系的增殖，是治療高原紅細(xì)胞增多癥的可能藥物。

紅系集落形成單位；促紅細(xì)胞生成素；抗體；骨髓；大鼠

在高原由于缺氧紅細(xì)胞增高，部分人員過(guò)度增高形成高原紅細(xì)胞增多癥(high altitude polycthemia，HAPC)。HAPC發(fā)病率高達(dá)到2.51%[1]，可以引起全身多器官損害，癥狀重，是危害高原人群健康的一種常見(jiàn)慢性高原病。目前對(duì)HAPC的治療還缺乏特效的方法與藥物[1]，急需要研究出有效的治療藥物。紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)在HAPC的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用，減低它的生物活性，可以調(diào)控紅細(xì)胞的生成，達(dá)到治療HAPC的目的。EPO多克隆抗體雖然可以減低EPO的生物活性[2]，但多克隆抗體有很多缺點(diǎn)，在臨床中使用受到限制，因此，開(kāi)發(fā)EPO單克隆抗體是必然趨勢(shì)。前期本研究利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備出了EPO單克隆抗體[3]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)該EPO單克隆抗體抑制EPO促紅細(xì)胞系形成的生物效能進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Rh-EPO(金坦生物技術(shù)有限公司)，EPO單克隆抗體(本院制備)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠共20只，均為雄性，體重143～155 g，從四川大學(xué)華西動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買(mǎi)。

1.3 研究方法

1.3.1 骨髓有核細(xì)胞懸液的制備 將SD大鼠處死取出股骨，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗出骨髓。將淋巴細(xì)胞分離液移入離心管中，加骨髓液形成界面，兩液體的體積比為1∶2。18 ℃、400g水平恒溫離心，吸取最上面一層。用DMEM液稀釋后重復(fù)以下操作2次：18 ℃、400g水平恒溫離心。最后采用逐步稀釋法，將細(xì)胞密度調(diào)至2.5×108/L。用2%臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)，活細(xì)胞率>95%。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 將上述分離的細(xì)胞隨機(jī)分為3組，即：空白對(duì)照組(不加EPO)、常規(guī)組(加EPO，不加EPO單克隆抗體)和EPO單克隆抗體干預(yù)組(EPO+EPO單克隆抗體)。分別進(jìn)行紅系集落形成單位(CFU-E)培養(yǎng)，空白對(duì)照組不加EPO；常規(guī)組加EPO，但不加EPO單克隆抗體；EPO單克隆抗體干預(yù)組加EPO和EPO單克隆抗體。各組加入的EPO及EPO單克隆抗體的濃度及量見(jiàn)表1。CFU-E培養(yǎng)采用甲基纖維素培養(yǎng)體系[4]。

表1 各組培養(yǎng)液體系成分

1.3.3 培養(yǎng)條件及時(shí)間 從表1各組甲基纖維素培養(yǎng)體系液分別取0.2 ml加入培養(yǎng)板一個(gè)孔中，每組加20個(gè)孔。在飽和濕度、5%CO2、37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)168 h。

1.4 CFU-E集落判定標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)數(shù) CFU-E集落判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞為橘紅色，集落內(nèi)細(xì)胞數(shù)≥8個(gè)。CFU-E集落計(jì)數(shù)方法：在顯微鏡下計(jì)數(shù)每單個(gè)培養(yǎng)孔全視野內(nèi)的CFU-E集落數(shù)量。

2 結(jié)果

空白對(duì)照組無(wú)CFU-E集落形成；常規(guī)組CFU-E集落數(shù)較多，每個(gè)培養(yǎng)孔CFU-E集落數(shù)平均值為151.8±23.3；EPO單克隆抗體干預(yù)組CFU-E集落數(shù)明顯減少(圖1)，每個(gè)培養(yǎng)孔CFU-E集落數(shù)平均值為10.7±3.9。EPO單克隆抗體干預(yù)組與常規(guī)組比較，CFU-E集落數(shù)非常顯著減少(P<0.01)。

圖1 各組CFU-E培養(yǎng)結(jié)果

A：空白對(duì)照組，無(wú)CFU-E集落；B：常規(guī)組，CFU-E集落數(shù)較多；C：EPO單克隆抗體干預(yù)組，CFU-E集落數(shù)減少

3 討論

HAPC血液學(xué)特點(diǎn)是紅細(xì)胞過(guò)度增多，紅細(xì)胞壓積增高，紅細(xì)胞變形能力減低，血液黏度增高，血液流動(dòng)阻力增加，血液運(yùn)氧能力下降，引起全身多器官、組織缺氧，對(duì)身體危害特別大。但目前在高原環(huán)境，由于缺氧這個(gè)發(fā)病的根本原因未消除，HAPC的治療還缺乏特效的方法[1]，急需要研究出有效的新藥物。另一方面，HAPC本質(zhì)上是一種繼發(fā)性紅細(xì)胞增多，其發(fā)病機(jī)制與真性紅細(xì)胞增多癥有本質(zhì)的區(qū)別。當(dāng)HAPC患者回到低海拔地區(qū)一定時(shí)間缺氧得到改善后，紅細(xì)胞可恢復(fù)到正常，其紅細(xì)胞增多是可逆的，也就是可以調(diào)控的，HAPC是可以治療的。

在紅細(xì)胞系的形成與成熟過(guò)程中，要經(jīng)過(guò)造血干細(xì)胞、紅系祖細(xì)胞、紅系前體細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞，最終形成成熟紅細(xì)胞。造血干細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞，大部分處于靜止期，部分處于增殖狀態(tài)，造血干細(xì)胞向何種細(xì)胞系分化、增殖，細(xì)胞因子起決定作用。當(dāng)EPO與造血干細(xì)胞上的受體結(jié)合后傳導(dǎo)信號(hào)，造血干細(xì)胞向紅系祖細(xì)胞分化與增殖[5]。紅系祖細(xì)胞上也存在EPO受體，在EPO的作用下，紅系祖細(xì)胞進(jìn)一步向前增殖與分化?？梢?jiàn)EPO在紅細(xì)胞系的形成中起重要作用，是HAPC發(fā)病的重要機(jī)制。在平原人群中，EPO的正常濃度為10～26 U/L，到高原后的幾小時(shí)內(nèi)已開(kāi)始明顯增加，此后一直高于平原水平[6]。在大部分HAPC患者，血漿EPO值顯著高于非HAPC人群。如果將EPO的生物活性降低，紅細(xì)胞的生成將減少，HAPC將得到根本意義上的治療。

當(dāng)EPO與EPO抗體結(jié)合后，可出現(xiàn)以下改變：EPO空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；出現(xiàn)空間位阻效應(yīng)；抗體至少是二價(jià)的特性，使一個(gè)抗體同時(shí)和兩個(gè)抗原結(jié)合，進(jìn)而最后形成數(shù)個(gè)EPO抗原與EPO抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物[7]。由于以上改變，影響EPO與其受體的結(jié)合或影響受體的二聚化，使信號(hào)傳道受阻，其生物活性降低或喪失，進(jìn)而阻礙骨髓紅細(xì)胞系的形成。

CFU-E是一種比較成熟的紅系祖細(xì)胞[8]，是紅細(xì)胞系的生成過(guò)程的重要標(biāo)志。在本研究中，空白對(duì)照組無(wú)CFU-E集落形成，而常規(guī)組CFU-E形成良好，單個(gè)培養(yǎng)孔CFU-E集落數(shù)平均值達(dá)到151.8±23.3；而在EPO單克隆抗體干預(yù)組，當(dāng)培養(yǎng)體系中加入EPO單克隆抗體后，每個(gè)培養(yǎng)孔CFU-E集落數(shù)平均值下降到10.7±3.9，說(shuō)明該EPO單克隆抗體可以抑制CFU-E形成，即抑制紅細(xì)胞系的形成。該EPO單克隆抗體有望用于HAPC的治療。

單克隆抗體用于臨床治療已有成功的范例，根據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，到2010年全球已經(jīng)上市的單克隆抗體至少有100多個(gè)[9]。該EPO單克隆抗體是使用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備的抗體[3,5]，具有性質(zhì)均一穩(wěn)定、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可通過(guò)細(xì)胞株體外培養(yǎng)長(zhǎng)期獲得，應(yīng)用前景廣闊。但是其為鼠源性抗體，是一種異種蛋白，可能產(chǎn)生免疫應(yīng)答，不能直接使用于人體。下一步將使用基因工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行人源化改造，降低其抗原性，以期用于臨床。

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Research on suppression of colony-forming unit-erythroid by EPO monoclonal antibody

Huang Xuewen,Li Suzhi,Huang Yue,Xie Xiaoe,Liu Houdong,Yan Chuncheng,Shi Quangui,Ding Haoping,He Feng,Chen You

Department of Mountain Sickness,General Hospital of Tibet Military Command,Lhasa,Tibet,850000,China

Objective To study whether EPO monoclonal antibody can inhibit the formation of colony-forming unit-erythroid(CFU-E).Methods Marrow samples collected from rats

oriented culture for CFU-E.According to the different culture conditions,the samples were divided into blank control group(without EPO),conventional group(with EPO,but without EPO monoclonal antibody),and intervention group with EPO monoclonal antibody(EPO+EPO monoclonal antibody).After the culturing for 168 hours,the levels of CFU-E in each group were observed.Results The average colony counts of CFU-E in the blank control group,conventional group,and EPO monoclonal antibody intervention group were 0.0±0.0,151.8±23.3,and 10.7±3.9,respectively.There were significant differences in the colony counts of C-FUE among the three groups(P<0.01).Conclusion EPO monoclonal antibody can significantly inhibit the formation of CFU-E and the erythron proliferation.It is a possible medicine for the treatment of high altitude polycythemia.

colony-forming unit-erythroid;erythropoietin;antibody;marrow;rat

拉薩市科技局資助合作項(xiàng)目(2004078)

850000 拉薩，西藏軍區(qū)總醫(yī)院高山病科

R 594.3

A

1004-0188(2014)01-0014-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.01.006

2013-12-05)