朱珣之，李強(qiáng)，2，華楠，季更生，2，李天程，屠潔，趙翔

（1 江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所附屬藥廠，江蘇 鎮(zhèn)江 212018）

果膠酶廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥、紡織、造紙、環(huán)境、飼料等領(lǐng)域，是工業(yè)中用途最廣的一類(lèi)酶[1]。但是目前果膠酶的使用方式多為一次性的，而且游離果膠酶在酶解反應(yīng)之后不能回收，無(wú)法多次利用。因此，果膠酶的回收和重復(fù)利用顯得尤為重要，果膠酶的固定化技術(shù)是實(shí)現(xiàn)果膠酶的回收和重復(fù)利用的有效手段。果膠酶的固定化載體主要有離子交換樹(shù)脂[2]、殼聚糖[3]和氧化石墨烯[4]等。固定化酶穩(wěn)定性有較大提高，對(duì)溫度等苛刻環(huán)境的適應(yīng)范圍增大，對(duì)抑制劑和蛋白酶的敏感性降低；有實(shí)現(xiàn)批量或連續(xù)操作的可能，適于產(chǎn)業(yè)化、連續(xù)化、自動(dòng)化生產(chǎn)[5-6]。但是固定化酶的回收仍然是需要解決的難題之一，人們尋求優(yōu)良的酶固定化載體，反應(yīng)完成后可通過(guò)簡(jiǎn)單的方法回收酶，酶活力下降不多且可以重復(fù)使用，也便于產(chǎn)品的分離和純化。由于磁性載體固定化酶在磁場(chǎng)作用下可從反應(yīng)體系中迅速分離，有利于回收和反復(fù)使用、降低成本，近年來(lái)，用磁性載體材料固定化酶越來(lái)越受到重視[7]。近年來(lái)報(bào)道的氧化石墨烯（graphene oxide，GO）含有眾多的含氧基團(tuán)，可利用其親水性進(jìn)行功能化和多種衍生化[8]。同時(shí)與其他碳材料相比氧化石墨烯具有較大的比表面積和豐富的表面活性基團(tuán)。由于氧化石墨烯具有較多的羧基，其可與酶蛋白中的氨基官能團(tuán)作用形成酰胺鍵[9]。雖然氧化石墨烯具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是其不具有磁性，這大大影響了其回收性能。磁性氧化石墨烯可以有效地用磁性設(shè)備回收，具有明顯的實(shí)用價(jià)值。磁性氧化石墨烯固定化酶的研究報(bào)道較少，目前的研究主要停留在磁性氧化石墨烯固定化蛋白水平的研究[10]和在生物傳感方面，目前還沒(méi)有應(yīng)用于酶催化反應(yīng)。固定化果膠酶未見(jiàn)報(bào)道。因此在本實(shí)驗(yàn)室前期工作制備的氧化石墨烯基礎(chǔ)上[4]，采用水熱共沉淀法制備了Fe3O4納米磁性氧化石墨烯（MGO），研究了MGO 固定化果膠酶的方法，確定了最佳固定化參數(shù)和固定化酶的特性。

1 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.1 主要原料與儀器

果膠、果膠酶（30000U/g）、納米石墨粉均購(gòu)阿拉丁試劑。N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、三聚氰酰氯、戊二醛、3,5-二硝基水楊酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、D-半乳糖醛酸、氯化高鐵、七水合硫酸亞鐵、氨水、硫酸、磷酸、鹽酸、過(guò)氧化氫、高錳酸鉀、考馬斯亮藍(lán)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

高速冷凍離心機(jī)，Sigma；DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器，上海比朗儀器有限公司；恒溫?fù)u床THZ-22-ISA，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；紫外-分光光度計(jì) UV759S，上海精科；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9101-ISA 型，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀，TENSOR27，德國(guó)布魯克光譜儀器公司。

1.2 Fe3O4/氧化石墨烯磁性納米復(fù)合材料的制備

氧化石墨烯的制備方法按照本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的方法制備[4]。取冷凍干燥的1.5g 氧化石墨烯，加入50mL 去離子水中，加入0.3g FeSO4·7H2O 和0.4g FeCl3·6H2O，室溫下劇烈攪拌，升溫至80℃。滴加氨水，調(diào)節(jié)至pH=10，攪拌30min，用永磁體收集黑褐色產(chǎn)物，并用蒸餾水反復(fù)洗滌5 次，渦旋振蕩使之分散于蒸餾水中備用，-40℃冷凍干燥，做紅外光譜檢測(cè)和電子顯微鏡掃描。

1.3 MGO 固定化果膠酶

在10mL 血清瓶中加入磁性氧化石墨烯5mg，加入4mL pH=5.0 的檸檬酸-檸檬酸鹽緩沖液，超聲振蕩10min。加入的果膠酶1mL（1mg/mL），并加入交聯(lián)劑（N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、三聚氰酰氯或戊二醛），冰水?。?℃）磁力攪拌反應(yīng)40min，用磁鐵將固定在MGO-果膠酶分離，用pH5.0 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液重復(fù)洗滌3 次4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。蛋白上載量計(jì)算公式如（1）。

式中，L 為上載量；Ci為酶液蛋白濃度；Cs為上清液中酶蛋白濃度；V 為體積；W 為酶液中酶含量。酶含量的測(cè)定以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，按照文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行測(cè)定。

果膠酶活力定義：每分鐘轉(zhuǎn)化果膠生成 1μg 半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)活力單位，用 U 表示。

相對(duì)酶活：為確定固定化果膠酶的最佳操作條件和比較固定化酶與游離酶的酶學(xué)性質(zhì)，以某一條件下的最大酶活為100%，其他酶活與其比值定位相對(duì)酶活。

1.4 酶動(dòng)力學(xué)考察

將果膠底物分別配成0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL 的溶液，在pH 值為5.0 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中測(cè)定520nm 處吸光度變化以計(jì)算酶反應(yīng)的初速度。以底物濃度[S]的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，酶反應(yīng)初速度(v)的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖，并比較游離酶，固定化果膠酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性氧化石墨烯的制備及紅外光譜表征

圖1 為氧化石墨烯制備過(guò)程圖，圖1(a)為超聲剝離后的懸浮液，由于懸浮液中含有未充分剝離的氧化石墨和少量的未充分氧化的石墨粉，懸浮液呈棕色。將剝離后的懸浮液15000r/min 離心則可以得到亮黃色的氧化石墨烯溶液[圖1(b)]。冷凍干燥則得到氧化石墨烯固體[圖1(c)]。圖1(d)為制得的磁性氧化石墨烯，將冷凍干燥后的氧化石墨烯超聲分散于蒸餾水中，加入Fe2+和Fe3+并與氨水發(fā)生劇烈反應(yīng)得到黑褐色沉淀，經(jīng)永磁體收集烘干后成磁性氧化石墨烯樣品。樣品呈黑褐色說(shuō)明氧化石墨烯的存在，磁性吸附實(shí)驗(yàn)說(shuō)明氧化石墨烯具有磁性[17～18]。將樣品置于蒸餾水中，經(jīng)超聲振蕩可得到水相中分散性良好的MGO。

圖1 磁性氧化石墨烯的制備

圖2 為石墨烯的紅外光譜圖。由譜線b 可知氧化石墨烯紅外光譜圖在波數(shù)為3456cm-1、1635cm-1、1390cmJ1、1226cm-1分別出現(xiàn) O—H，C=O， C—O，O—H 的特征吸收峰[4]，具有良好的親水性，其易與酶結(jié)合，易于分散于水相中。含氧基團(tuán)的存在說(shuō)明石墨已經(jīng)被氧化，表面羥基的存在使氧化石墨很容易與水分子形成氫鍵，賦予了氧化石墨烯良好的親水性[9]。譜線c 和譜線b 相比在638cm-1處多了一個(gè)強(qiáng)吸收峰，歸屬于 Fe—O—Fe 的伸縮振 動(dòng)[12]，電子顯微鏡圖可見(jiàn)納米鐵顆粒已經(jīng)與石墨烯片層結(jié)合[圖1(e)]，MGO 粉末可以被磁鐵強(qiáng)力吸引[圖1(d)]，因此說(shuō)明制得了Fe3O4納米粒子-氧化石墨烯復(fù)合物。譜線d 在2366cm-1、1247cm-1、1082cm-1出現(xiàn)N—H 的伸縮振動(dòng)[13]，說(shuō)明果膠酶已經(jīng)固定在在磁性氧化石墨烯上。

2.2 不同交聯(lián)劑對(duì)果膠酶固定化的影響

由于對(duì)磁性氧化石墨烯固定化酶的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，因此考察了不同交聯(lián)劑對(duì)果膠酶固定化的影響。結(jié)果表明，未加交聯(lián)劑、添加4%N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、4%三聚氰酰氯和4%戊二醛對(duì)果膠酶蛋白的上載量分別為 1114mg/g、1230mg/g、1224mg/g、1163mg/g。N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的果膠酶上載量最高，如圖3(a)所示。但是戊二醛交聯(lián)的果膠酶活性最高，產(chǎn)生的還原糖量為0.34mg/mL[圖3(b)]，因此選擇戊二醛作為磁性氧化石墨烯和果膠酶的交聯(lián)劑。繼而考察了不同戊二醛濃度對(duì)于磁性氧化石墨烯和果膠酶固定化的影響，見(jiàn)圖3(c)。結(jié)果表明，當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí)，固定化酶活性最高；低于8%時(shí)由于磁性載體表面的醛基較少，影響固定化酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，相對(duì)酶活較低。質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于8%時(shí)，戊二醛會(huì)使果膠酶變性而導(dǎo)致酶活損失。因此，選擇8%的戊二醛修飾磁性氧化石墨烯。

圖2 紅外光譜圖

圖3 交聯(lián)劑對(duì)果膠酶的影響

表1 表明與GO 相比磁性氧化石墨烯對(duì)于果膠酶的蛋白上載量由2400mg/g 降低至1453mg/g，但是還是遠(yuǎn)高于常見(jiàn)的磁性納米鐵（667mg/g）、固定化載體顆粒活性炭（637mg/g）和硅藻土（623mg/g）。因此磁性氧化石墨烯是較好的酶固定化載體。

表1 載體酶蛋白上載量

2.3 固定化果膠酶動(dòng)力學(xué)

由表2 可見(jiàn)，磁性氧化石墨烯固定化酶的催化轉(zhuǎn)化值Vm為3.17h-1，游離酶的催化轉(zhuǎn)化值為7.41h-1。同時(shí)從表2 中可以看出，磁性氧化石墨烯固定化酶和游離酶的催化效率分別為0.98mL/(h·mg)和1.54mL/(h·mg)，Km分別為2.06mg/mL 和7.55 mg/mL。酶濃度與催化轉(zhuǎn)化值的關(guān)系見(jiàn)圖4。果膠酶被固定化之后，空間位阻和活性中心位點(diǎn)受限使磁性氧化石墨烯與底物的親和力減弱，但是由于磁性氧化石墨烯具有較大的比表面積，固定化酶后的催化活性損失小，與游離的酶相差不大。

與游離酶相比，固定化酶可以重復(fù)使用。固定化酶的重復(fù)使用次數(shù)和酶活保持率反映了固定化酶的工業(yè)應(yīng)用潛力。由圖5 可見(jiàn)，固定化酶溫度穩(wěn)定性較好，在溫度超過(guò)50℃時(shí)固定化酶相對(duì)酶活可以保持在40%以上，而游離的酶活性大幅度降低至10%。而且在重復(fù)使用10 次后，酶活還能保持在初始酶活的58%，表明磁性石墨烯固定化果膠酶具有較好的操作穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

本工作制備的磁性氧化石墨烯具有—COOH 和—OH 等含氧基團(tuán)，具有良好的親水性，易與酶結(jié)合，易于分散于水相中，有利于果膠酶等水解酶固定化。磁性氧化石墨烯帶有磁性，幾乎可以完全回收重復(fù)利用?？疾炝瞬煌宦?lián)劑對(duì)酶上載量和活性的影響，選擇了8%戊二醛作為交聯(lián)劑。其果膠酶蛋白上載量可達(dá)1453mg/g，遠(yuǎn)高于常見(jiàn)的酶固定化載體顆粒活性炭和硅藻土。固定化酶后的催化活性損失小，與游離的酶相差不大，雖然與底物的親和力有所減弱，但其熱穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)，并具有較好的操作穩(wěn)定性，因此磁性氧化石墨烯是一種較好的酶固定化載體。

表2 酶催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)表

圖4 游離酶和固定化果膠酶酶促反應(yīng)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)圖

圖5 固定化果膠酶穩(wěn)定性考察

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