茍文軍 方晏紅 劉思源 劉靈琳 楊旭 李利文

【實驗研究】

SnoN蛋白及TGF-β在早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中表達及意義

茍文軍 方晏紅 劉思源 劉靈琳 楊旭 李利文

Accepted date：May 16，2014

From theDepartmentofOphthalmology，SuiningCentralHospital，Suining629000，SichuanProvince，China

糖尿病視網(wǎng)膜病變；SnoN蛋白；TGF-β

目的 觀察SnoN蛋白及TGF-β在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜上的表達，探討SnoN蛋白及TGF-β與糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)的關(guān)系，為DR發(fā)病機制的研究提供新的理論依據(jù)。方法 選擇健康雄性Wistar大鼠20只，隨機分為正常對照組與糖尿病(DM)組，每組各10只。采用一次性腹腔注射50 mg·kg-1鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)的方法建立DM大鼠模型，正常對照組一次性給予等體積檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液腹腔注射。分別于造模后8周和12周處死各組大鼠，均完整摘除各組大鼠的左眼球制成眼杯，采用免疫組織化學方法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜上SnoN蛋白及TGF-β蛋白的表達。結(jié)果 造模后8周和12周，DM組大鼠血糖值分別為(22.64±3.57)mmol·L-1、(24.08±1.60)mmol·L-1，均明顯高于正常對照組的(4.64±0.91)mmol·L-1、(4.50±0.66)mmol·L-1，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。正常對照組大鼠視網(wǎng)膜上TGF-β無表達或弱表達，在造模后8周和12周時，DM組大鼠視網(wǎng)膜上TGF-β的OD值分別為0.121 0±0.005 6、0.155 0±0.007 0，均較正常對照組(0.022 0±0.007 9、0.025 0±0.007 0)明顯增加(均為P<0.01)。正常對照組大鼠視網(wǎng)膜上SnoN蛋白高表達，在造模后8周和12周時，DM組大鼠視網(wǎng)膜上SnoN的OD值分別為0.412 0±0.011 3、0.214 0±0.006 9，均較正常對照組(0.945 0±0.007 0、0.944 0±0.005 1)明顯降低(均為P<0.01)，且隨著病程的延長，降低更明顯。結(jié)論 SnoN蛋白對TGF-β信號通路起負反饋抑制作用，能降低TGF-β信號的強度和持續(xù)時間，因此對DR的防治具有重要意義。

[眼科新進展，2014，34(11)：1035-1037]

泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑。TGF-β信號通路受到轉(zhuǎn)錄抑制因子的調(diào)控，而SnoN蛋白是細胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄共抑制因子，受UPP的降解調(diào)節(jié)。因此，本實驗通過觀察糖尿病大鼠模型視網(wǎng)膜上SnoN蛋白及TGF-β的表達，探討SnoN蛋白、TGF-β與DR之間的關(guān)系，從而為DR發(fā)病機制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 健康雄性SPF級Wistar大鼠20只，體質(zhì)量180～200 g(購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司)。將Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，應(yīng)用隨機數(shù)字表法將實驗動物隨機分為2組：正常對照組和DM組，每組各10只。

1.1.2 主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美國Sigma公司)；兔抗大鼠SnoN單克隆抗體、兔抗大鼠TGF-β單克隆抗體、DAB顯色試劑盒(北京中杉公司)；Accu-CHEK型血糖儀及其配套血糖試紙(瑞士羅氏公司)；眼科顯微剪、顯微鑷，前房穿刺刀(美國Alcon公司)；解剖顯微鏡(Leica，型號MDG29)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型的建立與標本制作 臨用前將STZ溶解于0.1 mmol·L-1檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液中(pH 4.5)，制成10 g·L-1STZ溶液。造模前將20只Wistar大鼠禁食12 h，DM組給予一次性腹腔注射50 mg·kg-1STZ，正常對照組一次性給予等體積的檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液(pH 4.5)腹腔注射。于造模后72 h尾靜脈測血糖，空腹血糖超過16.7 mmol·L-1者為造模成功。每隔2周測一次血糖及體質(zhì)量，分別于造模后8周和12周時測各組大鼠的血糖和體質(zhì)量，并處死各組大鼠。完整取出大鼠的左眼球，并在解剖顯微鏡下制成眼杯[1]。再將眼杯置于同一瓶中，取出眼杯后依次梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋供免疫組織化學染色使用。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的血糖水平比較 造模后8周和12周時，DM組大鼠血糖明顯高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01，見表1)。

表1 2組各時間點大鼠血糖水平比較

2.2 免疫組織化學染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜上TGF-β蛋白的表達 通過光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組大鼠視網(wǎng)膜上TGF-β無表達或弱表達(圖1A)；在造模后8周和12周時，DM組大鼠視網(wǎng)膜上TGF-β的表達較正常對照組明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01，見圖1B-圖1C，見表2)。

2.3 免疫組織化學染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜上SnoN蛋白的表達 通過光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組大鼠視網(wǎng)膜上SnoN高表達(圖2A)；在造模后8周和12周時，DM組大鼠視網(wǎng)膜上SnoN蛋白的表達均較正常對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01，見圖2B-圖2C，見表3)。

Figure 1 TGF-β expression in rat retina of two groups(SP，×400).A：The TGF-β was weakly expressed in rat retina of normal control group；B：At 8 weeks，the expression of TGF-β was elevated significantly in rat retina of DM group compared with normal control group；C：At 12 weeks，the expression of TGF-β was elevated significantly in rat retina of DM group compared with the time points of 8 weeks 光鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜上TGF-β的表達(SP染色，×400)。A：正常對照組大鼠視網(wǎng)膜上TGF-β弱表達；B：造模后8周時DM組大鼠視網(wǎng)膜上TGF-β的表達高于正常對照組；C：造模后12周時DM組大鼠視網(wǎng)膜上TGF-β的表達較8周時明顯升高

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜上TGF-β的OD值比較

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜上SnoN的OD值比較

Figure 2 SnoN expression in rat retina of two groups(SP，×400).A：The SnoN was expressed highly in rat retina of normal control group；B：At 8weeks，the expression of SnoN was reduced significantly in rat retina of DM group compared with normal control group；C：At 12 weeks，the expression of SnoN was reduced significantly in rat retina of DM group compared with the time points of 8 weeks 光鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜上SnoN蛋白的表達(SP染色，×400)。A：正常對照組大鼠視網(wǎng)膜上SnoN蛋白高表達；B：造模后8周時DM組大鼠視網(wǎng)膜上SnoN蛋白的表達明顯低于正常對照組；C：造模后12周時DM組大鼠視網(wǎng)膜上SnoN蛋白的表達較8周時降低

3 討論

DR是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一，可導致失明。DR病變機制正日益受到重視[2]。已有研究表明，細胞增殖調(diào)控的失常在DR發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要作用[3]。而細胞因子則貫穿于細胞生長增殖的全過程，介導一系列的炎癥反應(yīng)。TGF-β作為諸多細胞因子中的一種，具有調(diào)控細胞增殖與分化、凋亡及使細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積的作用[4]。而糖尿病時的高血糖、糖基化終末產(chǎn)物和血管緊張素Ⅱ是TGF的主要刺激因子[5]。近年來的研究揭示，TGF-β信號通路受到轉(zhuǎn)錄激活因子(如p300、CBP)和轉(zhuǎn)錄抑制因子的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄激活因子增強TGF-β的信號轉(zhuǎn)導，促進基因的轉(zhuǎn)錄；而轉(zhuǎn)錄抑制因子則降低TGF-β的信號轉(zhuǎn)導，抑制基因的轉(zhuǎn)錄，拮抗TGF-β的作用，因此組織中該抑制因子表達的水平在很大程度上影響TGF-β的生物學效應(yīng)。

SnoN蛋白是TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導通路中重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子[6-7]，可通過與TGF-β下游的Smad蛋白相互作用，進而調(diào)節(jié)TGF-β信號產(chǎn)生細胞效應(yīng)。研究表明當細胞內(nèi)TGF-β致Smad 2/3磷酸化，與Smad4形成復(fù)合物，SnoN蛋白就募集N-CoR蛋白、SMRT等轉(zhuǎn)錄共抑制因子，形成SnoN/N-CoR/SMRT復(fù)合物，使DNA上的組蛋白去乙?；种芐mad信號所致的基因轉(zhuǎn)錄?？梢?，SnoN蛋白對TGF-β信號通路起負反饋抑制作用，能降低TGF-β信號的強度和持續(xù)時間，對TGF-β信號的調(diào)控起關(guān)鍵作用。研究表明，在真核生物中，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)通過UPP進行降解[8]，因此，SnoN蛋白表達的減少與其泛素化降解有關(guān)。而我們的前期研究結(jié)果顯示，早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的表達降低，蛋白酶體抑制劑MG132可以使Smad7的表達增加[9]；早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜上特性泛素連接酶Smurf2表達增加，而其抑制劑MG132可下調(diào)Smurf2的表達[10]，提示DR時泛素蛋白酶體通路活化。而本實驗也通過免疫組織化學觀察發(fā)現(xiàn)，在正常對照組大鼠視網(wǎng)膜上TGF-β無表達或弱表達，SnoN蛋白高表達。而在造模后8周和12周時DM組大鼠視網(wǎng)膜上TGF-β的表達均較正常對照組明顯增加(均為P<0.01)，SnoN的表達均較正常對照組明顯降低(均為P<0.01)，且隨著病程的延長，降低更明顯。由此說明，SnoN蛋白對TGF-β信號通路起負反饋抑制作用，能降低TGF-β信號的強度和持續(xù)時間，因此對DR的防治具有重要意義。

1 呂紅彬，袁援生，李燕，李俊.鼠青光眼模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中熱休克蛋白27表達的研究[J].中華眼科雜志，2005，41(6)：533-539.

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5 Reeves WB，Andreoli TE.Transforming growth factor beta contributes to progressive diabetic nephropathy[J].ProcNatlAcadSciUSA，2000，97(14)：7667-7669.

6 Sarker KP，Wilson SM，Bonni S.SnoN is a cell type-specific mediator of transforming growth factor-beta responses[J].BiolChem，2005，208(13)：13037-13046.

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8 Voorhees PM，Dees EC，O’Neil B，Orlowski RZ.The Proteasome as a target for Cancer Therapy[J].ClinCancerRes，2003，9(17)：6316-6325.

9 茍文軍，劉思源，覃冬.泛素-蛋白酶體抑制劑MG132對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜上Smad7表達的影響[J].眼科新進展，2012，32(11)：1014-1016.

10李利文，茍文軍.泛素-蛋白酶體抑制劑MG132對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜上Smurf2及Smad7表達的影響[J].實用醫(yī)院臨床雜志，2013，10(5)：60-63.

date：Feb 17，2014

Expressions of SnoN protein and TGF-β in retinas of early diabetic rats and its significance

GOU Wen-Jun，F(xiàn)ANG Yan-Hong，LIU Si-Yuan，LIU Ling-Lin，YANG Xu，LI Li-Wen

diabetic retinopathy；SnoN protein；TGF-β

Objective To investigate the expression of SnoN and TGF-β in the retinas of diabetic rats，then study the role of the SnoN and TGF-β in diabetic retinopathy，and provide a new theoretical basis for studying DR pathogenesis.Methods Twenty male Wistar rats were randomly divided into normal control group and DM group，10 cases in each group.DM model was established by intraperitoneal injection of 50 mg·kg-1STZ.At 8 weeks and 12 weeks，the rats were sacrificed and removed left eyeballs to make the eye cups.SnoN and TGF-β protein expression in the retina were detected by immunohistochemistry.Results At 8 weeks and 12 weeks，the blood glucose in DM group were (22.64±3.57)mmol·L-1and (24.08±1.60)mmol·L-1，respectively，which were higher than those in normal control group (4.64±0.91)mmol·L-1and (4.50±0.66)mmol·L-1，there were significant differences (allP<0.01).The TGF-β was expressed weakly or was not expressed in rat retina of normal control group.At 8 weeks and 12 weeks，the value of average optical density of TGF-β were 0.121 0±0.005 6 and 0.155 0±0.007 0 in rat retina of DM group.Compared with normal control group(0.022 0±0.007 9 and 0.025 0±0.007 0)，TGF-β of rat retina expression in DM group were elevated significantly(allP<0.01).The SnoN protein was expressed highly in rat retina of normal control group.At 8 weeks and 12 weeks，the value of average optical density of SnoN were 0.412 0±0.011 3 and 0.214 0±0.006 9 in rat retina of DM group.Compared with normal control group(0.945 0±0.007 0 and 0.944 0±0.005 1)，SnoN of rat retina expression in DM group were reduced significantly(allP<0.01)，and it was reduced furtherly with the extension of time.Conclusion The SnoN protein maybe reduce the intensity and duration of TGF-β signaling with the role of negative feedback inhibition，so has the great significance for the prevention and control of DR.

茍文軍，方晏紅，劉思源，劉靈琳，楊旭，李利文.SnoN蛋白及TGF-β在早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中表達及意義[J].眼科新進展，2014，34(11)：1035-1037.

10.13389/j.cnki.rao.2014.0286

茍文軍，男，1984年1月出生，四川遂寧人，在讀碩士研究生。聯(lián)系電話：15983064437；E-mail：gwjlwj2008@aliyun.com

About GOU Wen-Jun：Male，born in January，1984.Postgraduate student.Tel：15983064437；E-mail：gwjlwj2008@aliyun.com

2014-02-17

629000 四川省遂寧市，遂寧市中心醫(yī)院眼科

修回日期：2014-05-16

本文編輯：付中靜

[Rec Adv Ophthalmol，2014，34(11)：1035-1037]