李泉，俞淵，黃欣，王兵，王克凈，呂震，李輝，金萌，唐乾利②

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011 E－mail：doctoryuyuan＠163.com；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；3.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

膽囊結(jié)石為臨床常見病、多發(fā)病，傳統(tǒng)的處理方法就是行開放或者微創(chuàng)膽囊切除。近年來，保膽取石手術(shù)方式成為治療膽囊結(jié)石的一種新術(shù)式。然而由于術(shù)后較高殘石率及復(fù)發(fā)率的存在，保膽取石一直未被廣大醫(yī)護(hù)人員及患者接受。為了降低保膽取石術(shù)后復(fù)發(fā)率，除了手術(shù)過程中完全取盡結(jié)石，術(shù)后藥物的干預(yù)越來越顯得重要。雖然術(shù)后膽結(jié)石復(fù)發(fā)的成因研究迄今為止仍未完全定論，但目前的研究表明，膽結(jié)石的形成是多種因素綜合作用的結(jié)果［1］，其中病人肝組織中膽固醇7a－羥化酶（cholesterol 7a－h(huán)ydroxylase，CYP7A）的降低及膽囊結(jié)石對(duì)膽囊黏膜損傷后，黏膜修復(fù)緩慢都可能成為結(jié)石復(fù)發(fā)的因素。為進(jìn)一步探討大黃靈仙膠囊在分子層面防治膽石病的機(jī)制，我們開展了以下初步基礎(chǔ)研究與臨床研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建造 廣西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心已獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證（SYXK桂2003－0001），可提供SPF級(jí)動(dòng)物（豚鼠）。采用誘導(dǎo)產(chǎn)生結(jié)石的致石餌料方法［2］：紅目雄性豚鼠，清潔級(jí)，質(zhì)量250～300g。用標(biāo)準(zhǔn)飼料加1.2%膽固醇，5%蔗糖，3.5%魚肝油。喂飼2個(gè)月可誘發(fā)以膽固醇為主的混合性結(jié)石，成石率91%。實(shí)驗(yàn)中注意環(huán)境濕度［3］，造模時(shí)間連續(xù)4周。

1.1.2 主要儀器與試劑 高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司），LEICADM LB2型雙目顯微鏡（德國LEICA公司），Motic B5顯微攝像系統(tǒng)麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司），Shandon325型石蠟切片機(jī)（英國Sh），鼠抗人CYP7A多克隆抗體（武漢博士德），羊抗鼠二抗（武漢博士德），免疫組化SP試劑盒（福州邁欣生物技術(shù)公司），DAB顯色試劑盒 （北京金橋生物技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 紅目雄性豚鼠，清潔級(jí)，共80只，體重250～300g。隨機(jī)分為兩組，即對(duì)照組40只，大黃靈仙膠囊組40只。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 對(duì)照組喂致石飼料及適量青菜；大黃靈仙膠囊組按照對(duì)照組的食量喂致石飼料及適量青菜，同時(shí)加喂中藥大黃靈仙膠囊。喂養(yǎng)4周后，采用斷頸處死法處死所有豚鼠，留取相同部位肝組織以液氮迅速冷凍保存，留作檢測肝組織CYP7A表達(dá)。留取各組膽囊標(biāo)本，檢查膽囊內(nèi)有無結(jié)石形成，測量膽囊壁厚度，病理切片觀察膽囊黏膜病變情況。

1.2.3 臨床研究 選取2011年1月～2013年1月期間，來自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院、廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受保膽取石手術(shù)的膽囊結(jié)石患者120例，符合診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，其中男66例，女54例，年齡20～68歲，平均年齡41.5歲；采取組間對(duì)照，按完全隨機(jī)化原則分為實(shí)驗(yàn)組（大黃靈仙膠囊組）、陽性對(duì)照組（?；撬嵝苋ツ懰峤M）及空白對(duì)照組，每組40例。實(shí)驗(yàn)組男22例，女18例，平均年齡（40.6±8.6）歲；陽性對(duì)照組男20例，女20例，平均年齡（41.8±10.1）歲；空白對(duì)照組男24例，女16例，平均年齡（39.6±11.3）歲。三組患者性別、年齡間有均衡性。實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組術(shù)后第2d正常進(jìn)食后按分組予以給藥，空白對(duì)照組不予藥物，按術(shù)后常規(guī)處理。連續(xù)服藥3個(gè)療程，隨訪術(shù)后1、3、6、12個(gè)月后癥狀改善情況，通過B超檢查結(jié)石復(fù)發(fā)或者膽泥形成情況及膽囊黏膜炎癥情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及四格表精確概率法，計(jì)量資料采用單因素ANOVA－LSD檢驗(yàn)，結(jié)果用（）表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各組成石率觀察及膽囊壁厚度 實(shí)驗(yàn)組有5只膽囊內(nèi)形成結(jié)石，成石率為12.50%；對(duì)照組有22只膽囊內(nèi)形成結(jié)石，成石率為55.00%。兩組成石率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組膽囊壁厚度（1.27±0.71）mm，對(duì)照組膽囊壁厚度（2.02±0.68）mm，兩組膽囊壁厚度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），見表1。

表1 各組成石率及膽囊壁厚度比較

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膽囊組織病理切片情況 實(shí)驗(yàn)組無結(jié)石或者膽泥形成動(dòng)物的膽囊壁光滑，個(gè)別有輕度增厚和充血改變，鏡下可見膽囊黏膜基本保持完整（見圖1A）；有結(jié)石或膽泥形成動(dòng)物膽囊黏膜表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，局部可見增生（見圖1B）。對(duì)照組有結(jié)石或膽泥形成動(dòng)物膽囊壁明顯增厚，粗糙，鏡下膽囊壁呈亞急性炎癥改變，明顯充血，炎癥細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，局部可見增生，膽囊黏膜斷裂，潰瘍樣變（見圖1C）。

圖1 各組動(dòng)物膽囊組織病理切片情況（×100倍）

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各組CYP7A的表達(dá)情況 各組肝組織切片行免疫組化，顯微鏡下檢查發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物肝臟組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，陽性表達(dá)率為（67.5±5.87）%（見圖2A），對(duì)照組動(dòng)物肝臟組織中也有表達(dá)，陽性表達(dá)率為（31.8±4.59）%（見圖2B）。兩組CYP7A表達(dá)率不同，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見表2。

圖2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組CYP7A的表達(dá)情況

表2 各組動(dòng)物肝臟組織的CYP7A表達(dá)情況

2.4 各組臨床癥狀改善情況的比較 臨床研究中，綜合分析患者術(shù)后1年內(nèi)臨床癥狀改善情況，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組患者臨床癥狀明顯改善，實(shí)驗(yàn)組有1例、陽性對(duì)照組有4例患者偶有右上腹隱痛，可以自行緩解；而沒有服用利膽排石藥物的空白對(duì)照組有10例患者出現(xiàn)不同程度的腹痛癥狀。實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組臨床癥狀改善率分別為97.50%和90.00%，空白對(duì)照組臨床癥狀改善率為75.00%。實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組臨床癥狀改善率優(yōu)于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 三組組間臨床癥狀改善情況的比較

2.5 各組患者膽囊黏膜炎癥改善情況 定期隨訪，行B超檢查了解患者術(shù)后1年內(nèi)膽囊黏膜炎癥改善情況。膽囊黏膜光滑或者與術(shù)前對(duì)比變薄，結(jié)果判定為有效；膽囊黏膜粗糙或者與術(shù)前對(duì)比增厚，結(jié)果判定為無效。實(shí)驗(yàn)組有34例、陽性對(duì)照組有31例患者膽囊黏膜恢復(fù)正常，空白對(duì)照組有25例患者膽囊黏膜恢復(fù)正常。實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組膽囊黏膜炎癥改善率分別為85.00%和77.50%，空白對(duì)照組臨床癥狀改善率為62.50%。實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組膽囊黏膜炎癥改善優(yōu)于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 三組組間膽囊黏膜炎癥改善情況的比較

2.6 各組患者膽囊結(jié)石或者膽泥形成情況 術(shù)后隨訪行B超檢查，膽囊內(nèi)有結(jié)石或者膽泥形成判定為復(fù)發(fā)；膽囊內(nèi)無結(jié)石或者膽泥形成判定為正常。實(shí)驗(yàn)組有1例、陽性對(duì)照組有1例患者術(shù)后1年內(nèi)結(jié)石復(fù)發(fā)，空白對(duì)照組有4例患者結(jié)石復(fù)發(fā)。實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組膽囊結(jié)石復(fù)發(fā)率分別為2.50%和2.50%，空白對(duì)照組膽囊結(jié)石復(fù)發(fā)率為10.00%。實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組膽囊結(jié)石復(fù)發(fā)率低于陰性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見表5。

表5 三組組間結(jié)石復(fù)發(fā)情況的比較

3 討論

膽囊結(jié)石是我國的一種常見多發(fā)病，近年來在我國相對(duì)發(fā)病率雖有所下降，但仍占全部膽石癥病例的16.1%［5］。目前外科治療是膽石癥治療鏈環(huán)中重要的一環(huán)［6］。而近年來保膽取石術(shù)式的臨床研究較為活躍，而目前保膽取石的術(shù)式不足之處在于存在著一定的復(fù)發(fā)率［7－8］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該術(shù)式術(shù)后5～10年的復(fù)發(fā)率約為30%～40%［9－12］。如何減低結(jié)石復(fù)發(fā)，成為我們研究的重要對(duì)象。大量的研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸與膽固醇、膽紅素代謝失調(diào)和膽結(jié)石的形成關(guān)系密切，膽汁中膽固醇、膽紅素過飽和是膽石形成的前提條件，膽汁熱力學(xué)失衡是膽石形成的基礎(chǔ)。因此CYP7A作為經(jīng)典途徑的起始酶，對(duì)膽汁改變有至關(guān)重要的作用。有人對(duì)肝內(nèi)膽管結(jié)石患者肝臟HMGCOA還原酶及CYP7AmRNA豐度及酶的活性檢測發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性膽管內(nèi)膽固醇合成的向上調(diào)節(jié)及膽汁酸合成的向下調(diào)節(jié)，導(dǎo)致了膽汁膽固醇過飽和及含豐富膽固醇的色素結(jié)石的形成，膽石癥患者的CYP7AmRNA水平低于一般人群［13］。大黃靈仙膠囊為治療膽石病的有效經(jīng)驗(yàn)方，方中生大黃、芒硝攻下導(dǎo)滯、利膽排石；金錢草、郁金、柴胡、枳殼、澤蘭相伍，既有清熱利濕之功，又有理氣祛痰之效；雞內(nèi)金、金錢草、威靈仙為排石佳品；威靈仙、磁石為經(jīng)驗(yàn)用藥；黃芪、甘草意在益氣補(bǔ)虛，保護(hù)胃氣。諸藥合用共奏疏肝利膽，攻下排石的功效。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，大黃仙靈膠囊有上調(diào)肝臟細(xì)胞CYP7A蛋白表達(dá)的作用，可見大黃靈仙膠囊具有顯著降低膽石癥術(shù)后復(fù)發(fā)率作用。

在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)大黃靈仙膠囊具有很好的預(yù)防膽結(jié)石形成的作用［14－15］，它通過調(diào)節(jié)豚鼠肝細(xì)胞相關(guān)基因CYP7A的表達(dá)量，改善肝功能，增加膽汁中總膽汁酸的含量等，而膽結(jié)石形成率與肝組織損傷程度以及膽汁中總膽汁酸的含量呈正相關(guān)［16］。使致石性膽汁趨向正常化，減少膽石的形成。在我們的動(dòng)物試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物肝臟組織細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中CYP7A陽性表達(dá)率與對(duì)照組動(dòng)物有著明顯的差異，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組成石的差異也在一定程度上證實(shí)了該觀點(diǎn)。同時(shí)在我們的臨床試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組有34例、陽性對(duì)照組有31例患者膽囊黏膜恢復(fù)正常，空白對(duì)照組有25例患者膽囊黏膜恢復(fù)正常。實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組膽囊黏膜炎癥改善率分別為85.00%和77.50%，空白對(duì)照組臨床癥狀改善率為62.50%。實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組膽囊黏膜炎癥改善優(yōu)于空白對(duì)照組。表明大黃仙靈膠囊不僅可以調(diào)節(jié)CYP7A基因的表達(dá)，同時(shí)對(duì)膽囊壁炎癥的修復(fù)有較好的作用，從而有利于我們降低保膽術(shù)后膽囊結(jié)石復(fù)發(fā)率。

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