劉 涵，王金芳，高增平，史家文，石 鉞

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102; 2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

指甲花Lawsonia inermis L. 是維吾爾醫(yī)常用藥材之一，盡管 很常用，但實(shí)際上新疆并不出產(chǎn)，從古至今維吾爾醫(yī)用指甲花均由國外進(jìn)口。近幾十年來，由于維吾爾醫(yī)藥的發(fā)展，進(jìn)口指甲花已無法滿足維吾爾醫(yī)臨床應(yīng)用和化妝品生產(chǎn)的需求，加之維吾爾族的語言不通、交通不便、信息不暢，不了解我國南方地區(qū)也有指甲花的野生和栽培資源，所以誤認(rèn)為新疆地區(qū)栽培的亦能染指甲的鳳仙花Impatiens balsamina L. 即是指甲花[1-4]。同時(shí)，盡管指甲花和鳳仙花的原植物科屬不同，前者屬于千屈菜科，后者屬于鳳仙花科，但兩者的葉均可染色，其著色成分也很相似，且植物葉粉碎后難以用肉眼加以區(qū)分，這就給臨床應(yīng)用和市場流通造成很大困難。國外學(xué)者曾采用高效液相色譜(HPLC)法或薄層色譜(TLC)法對指甲花的指紋圖譜進(jìn)行過研究[5-7]，但對于指甲花和鳳仙花的定性鑒別，目前尚未見報(bào)道。筆者采用TLC 法和HPLC 法對指甲花和鳳仙花的指紋圖譜進(jìn)行比較，建立了兩者的特征定性鑒別方法，為指甲花和鳳仙花的正確應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

UVⅢ型暗箱式三用紫外分析儀(北京恒誠基業(yè)科貿(mào)有限公司);Water2695 型高效液相色譜儀(Waters2996 二極管陣列檢測器);AB135-S 型十萬分之一分析天平(瑞士梅特勒公司);SB-5200D 型超聲波清洗機(jī)(中國寧波);TG16 -Ⅱ型高速離心機(jī)(中國長沙);薄層層析用硅膠G(青島海洋化工廠)。甲醇和三氟醋酸(TFA)為色譜純;水為娃哈哈純凈水;其他化學(xué)試劑均為分析純。指甲花葉分別自采和購買于福建、海南、云南、廣東、印度和巴基斯坦，鳳仙花葉自采于新疆和北京，原植物由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所石鉞研究員鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

稱取0.5 g 樣品的干燥粉，精密稱定0.1 mg，過40 目篩，置50 mL 具塞刻度離心管中，精密加入20 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(控制超聲溫度在30 ℃以下)，置室溫，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，以5 000 r/min的速率離心5 min，取上清液，即得供試品溶液。精密吸取上述溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，展開前先預(yù)飽和30 min，用氯仿-甲醇(12 ∶1)為展開劑展開，展距在8 cm 以上，取出，晾干，置365 nm波長紫外光燈下檢識。結(jié)果6 種不同產(chǎn)地的指甲花均可檢出Rf 為0.45 和0.51 的紅色熒光斑點(diǎn)，鳳仙花未檢出;鳳仙花可檢出Rf=0.74 的紫色熒光斑點(diǎn)，指甲花未檢出(見圖1)。試驗(yàn)結(jié)果表明，指甲花和鳳仙花的薄層色譜有顯著性差異。

圖1 藥材薄色譜圖

2.2 HPLC 鑒別

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil? C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:A 為甲醇，B 為0.05%TFA 水溶液，按表1 方法進(jìn)行梯度洗脫;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;在線檢測波長:245 nm。

2.2.2 供試品溶液制備

取2.1 項(xiàng)下供試品溶液，用0.45 μm 濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn):取同一指甲花供試品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定指紋圖譜，考察各共有指紋峰的相對保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果顯示，各共有指紋峰相對保留時(shí)間的RSD 均小于2% (0.030% ～1.400% )，各 峰 峰 面 積 的 RSD 均 小 于3%(0.371% ～2.435%)，符合相關(guān)規(guī)定，表明其精密度良好。

表1 甲醇-0.05%TFA 水二元梯度表

重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取同一指甲花樣品，平行操作6 份，每份約0.5 g，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測定指紋圖譜，考察各共有指紋峰的相對保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果顯示，各共有指紋峰相對保留時(shí)間的RSD 均小于1%(0.040% ～0.263%)，各峰峰面積的RSD 均小于2%(0.320% ～1.500%)，符合相關(guān)規(guī)定，表明其重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h 時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定指紋圖譜。結(jié)果顯示，各共有指紋峰相對保留時(shí)間的RSD 均小于2%(0.011% ～1.342%)，各峰峰面積的RSD 均小于5%(0.359% ～4.809%)，表明指甲花供試品溶液在8 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。但隨著時(shí)間的增加，某些峰的峰面積逐漸減小，影響測定，故指甲花供試品溶液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，且應(yīng)在8 h 內(nèi)進(jìn)行測定。

2.2.4 結(jié)果

按2.2.2 項(xiàng)下方法制備指甲花和鳳仙花的供試品溶液，在擬訂色譜條件下進(jìn)樣。測定各批供試品溶液的指紋圖譜，記錄時(shí)間為105 min。色譜圖見圖2 至圖5。

圖2 2 批鳳仙花藥材指紋圖譜的疊加圖

圖3 6 批指甲花藥材指紋圖譜的疊加圖

圖4 2 批鳳仙花藥材和6 批指甲花藥材指紋圖譜的疊加圖

圖5 指甲花藥材的特征色譜峰

因鳳仙花種類和分布過于廣泛，本研究中僅通過對北京和新疆兩個(gè)產(chǎn)地差別較大的鳳仙花進(jìn)行HPLC 鑒別研究，結(jié)果見圖2?？梢姡煌a(chǎn)地的鳳仙花化學(xué)成分可能無顯著性差異。因目前指甲花在國內(nèi)種植很少，故僅能對已知分布在福建、海南、云南、廣東等地的栽培指甲花和市場中流通最廣的印度、巴基斯坦指甲花進(jìn)行分析研究，結(jié)果見圖3?？梢姡煌a(chǎn)地的指甲花化學(xué)成分雖有一定差異，但仍具有明顯的共有特征。通過對鳳仙花和指甲花HPLC 指紋圖譜的比較(見圖4)，發(fā)現(xiàn)鳳仙花和指甲花的化學(xué)成分確實(shí)存在相似性，但各自又有其明顯的特異性。鳳仙花中所含極性較大的化學(xué)成分含量明顯低于指甲花，通過指甲花的共有峰與鳳仙花的比較，共確定了8 個(gè)指甲花的特征性色譜峰(見圖5)，其保留時(shí)間分別為t1=2.797，t2=8.633，t3=22.606，t4=35.962，t5=52.996，t6=57.233，t7=58.569，t8=71.137。

3 討論

指甲花與鳳仙花均有染色作用，且植物葉粉碎后難以用肉眼加以區(qū)分，但實(shí)際上是兩種不同科屬的植物，應(yīng)嚴(yán)格區(qū)別，不能混用。本研究中建立了指甲花和鳳仙花的TLC 和HPLC 鑒別方法，結(jié)果表明，所建立的TLC 法可初步鑒別指甲花和鳳仙花;HPLC法鑒別表明，不同產(chǎn)地的鳳仙花化學(xué)成分可能差別不大，不同產(chǎn)地的指甲花雖存在一定的差異性，但仍具有明顯的共有特征。利用HPLC 法鑒別指甲花和鳳仙花時(shí)，可根據(jù)其極性較大的化學(xué)成分的含量結(jié)合是否具有指甲花的特征色譜峰加以判斷。本研究方法的建立，也為維吾爾藥指甲花的質(zhì)量控制提供了鑒別依據(jù)。

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