傅若秋，盧來(lái)春，李卓恒，余 瓊，張雪梅

(1. 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院，重慶 400042; 2. 西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715;3. 重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，重慶 400016)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是導(dǎo)致壞死性肺炎、嚴(yán)重?cái)⊙Y、壞死性筋膜炎等疾病的重要致病菌[1]，嚴(yán)重威脅人類健康，其防治已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。萬(wàn)古霉素是目前臨床上確證對(duì)MRSA 最有效的藥物，但許多國(guó)家(包括中國(guó))均已發(fā)現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥的MRSA[2]。一旦MRSA 發(fā)展到對(duì)萬(wàn)古霉素普遍耐藥，MRSA 感染患者將面臨無(wú)藥可治的危險(xiǎn)境地，因此研究開(kāi)發(fā)針對(duì)MRSA 的新型抗菌藥物刻不容緩。天然植物特別是中草藥中蘊(yùn)含著多種多樣的天然活性物質(zhì)，從中篩選抗MRSA 藥物有良好的前景。筆者在對(duì)31 種中藥單體進(jìn)行篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，其中9 種具有抗MRSA 作用，對(duì)其進(jìn)行了抗菌活性初步研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

中藥單體:青蒿素(artemisinin)、苦參堿(matrine)、胡椒堿(piperine)、厚樸酚(magnolol)、白秋李醇(patchouialcohol)、齊墩果酸(oleanic acid)、蛇床子素(oosthole)、梔子苷(geniposide)、五味子甲素(schizandrin A)、鹽酸水蘇堿(stachydrine hydrochloride)、二氫楊梅素(dihydromyricetin)、根皮苷(phloridzin)、姜黃素(curcumin)、甜菜堿(betaine)、莽草酸(shikimic acid)、水飛薊賓(silymarin)、秦皮 甲 素 (esculin)、巖 白 菜 素 (bergenin)、原 花 青 素(proanthocyanidins)、熊果酸(vrsolic Acid)、補(bǔ)骨脂素(psoralen)、連翹苷(phillyrin)、楊梅苷(myricetrin)、蘆竹堿(gramine)、胡黃連翹苷Ⅱ(picroside Ⅱ)、獐 芽 菜 苦 苷(swertiamarin)、五 味 子 乙 素(schizandrin B)、花旗松素(taxifolin)、對(duì)香豆素(p -coumoric acid)、豆腐果酸(helicid)，均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司;仙鶴草酚B (agrimol B)購(gòu)于四川成都曼斯特生物科技有限公司。

菌種:MRSA 臨床分離菌株(第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科)。

培養(yǎng)基:Luria-Bertani 培養(yǎng)基(LB，自行配制)，LB 配方為酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，pH=7.2 ～7.4。

藥敏紙片:萬(wàn)古霉素、頭孢西丁、苯唑西林、頭孢呋辛、四環(huán)素、替考拉寧、氯霉素、利福平、紅霉素、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、青霉素、慶大霉素、克林霉素藥敏紙片，均購(gòu)自英國(guó)OXOID 公司。

瓊脂平板:血瓊脂平板(CN)、M-H 藥敏試驗(yàn)瓊脂平板(重慶龐通醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 方法

1.1.1 中藥單體溶液制備

將每種中藥單體用50%的二甲基亞砜(DMSO)配制成4 g/L的溶液，滅菌后置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。臨用前取出，在無(wú)菌操作臺(tái)上用滅菌的50% DMSO 溶液倍比稀釋至2，1，0.5，0.25，0.125 g/L 6 個(gè)質(zhì)量濃度，備用。

1.2.2 菌液制備

將菌種接種于含LB 培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃孵箱中培養(yǎng)約24 h，用培養(yǎng)基調(diào)整其吸光度值(OD)值為0.8，再用培養(yǎng)基稀釋1 000 倍，相當(dāng)于菌液濃度為105 ～106 CFU/mL，備用。

1.2.3 抑菌試驗(yàn)

MRSA 耐藥性鑒定:采用(K-B)紙片擴(kuò)散法測(cè)試MRSA 對(duì)不同抗菌藥物的敏感性。將菌液100 μL 均勻涂于M-H 瓊脂平板上，待干后，分別貼上萬(wàn)古霉素、頭孢西丁、苯唑西林、頭孢呋辛、四環(huán)素、替考拉寧、氯霉素、利福平、紅霉素、頭孢唑林、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、青霉素、慶大霉素、克林霉素藥敏紙片，于37 ℃恒溫箱中孵育24 h，測(cè)定抑菌環(huán)的大小，判斷其對(duì)藥物的敏感性。

初篩:于無(wú)菌96 孔板中每孔加入菌液160 μL、濃度為4 g/L的中藥單體溶液40 μL，每種中藥單體重復(fù)3 次;另取菌液160 μL、50%DMSO 溶液40 μL 作為陽(yáng)性菌對(duì)照孔;取培養(yǎng)基160 μL、50%DMSO 溶液40 μL 作為陰性菌對(duì)照孔。于37 ℃孵箱中培養(yǎng)24 h，肉眼觀察培養(yǎng)液澄清者，表明其對(duì)應(yīng)的中藥單體有一定抑菌作用，用于后續(xù)試驗(yàn)。

抑菌或殺菌作用測(cè)定:于無(wú)菌96 孔板中每孔加入菌液160 μL、分別加入質(zhì)量濃度為4，2，1，0.5，0.25，0.125 g/L 的中藥單體溶液40 μL(相當(dāng)于培養(yǎng)體系中單體質(zhì)量濃度分別為800，400，200，100，50，25 μg/mL)，每種單體每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3 次;另取菌液160 μL、滅菌的50%DMSO 溶液40 μL，作為陽(yáng)性菌對(duì)照孔;取培養(yǎng)基160 μL、50%DMSO 溶液40 μL，作為陰性菌對(duì)照孔。于37℃孵箱中培養(yǎng)24 h。肉眼觀察培養(yǎng)液澄清者表明所對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的中藥單體有抑菌作用。將肉眼觀察到的澄清培養(yǎng)液取20 μL 轉(zhuǎn)種至血平板中，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h 后觀察結(jié)果，血平板中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)濃度的中藥單體有殺菌作用。計(jì)算不同質(zhì)量濃度的中藥單體對(duì)11 株MRSA 的抑菌率和殺菌率。

2 結(jié)果

2.1 MRSA 耐藥性鑒定

用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法檢測(cè)金黃色葡萄球菌對(duì)苯唑西林的耐藥性，可作為臨床實(shí)驗(yàn)室確證MRSA 的一種簡(jiǎn)便而有效的方法[3]，采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，結(jié)果11 株MRSA 均對(duì)苯唑西林、頭孢西丁耐藥;此外，11 株MRSA 對(duì)其他β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基苷類等常見(jiàn)抗菌藥物均有不同程度的耐藥，符合MRSA 多重耐藥特征。11株MRSA 對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的耐藥情況分析見(jiàn)表1。

2.2 初篩結(jié)果

31 種中藥單體中有9 種對(duì)MRSA 表現(xiàn)出抗菌活性，分別為花旗松素、二氫楊梅素、原花青素、姜黃素、熊果酸、白秋李醇、水飛薊賓、蘆竹堿、楊梅苷。

2.3 抑菌/殺菌作用測(cè)定結(jié)果

抑菌作用:9 種中藥單體均對(duì)11 株MRSA 具有一定的抑菌作用，在質(zhì)量濃度為800 μg/mL 時(shí)對(duì)11 株MRSA 的抑菌率大多達(dá)100%，但質(zhì)量濃度為25 μg/mL 時(shí)對(duì)MRSA 均無(wú)抑菌作用。其中花旗松素的抑菌作用最強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為50 μg/mL 時(shí)對(duì)11 株MARS 的抑菌率即可達(dá)100%;其次是二氫楊梅素，在質(zhì)量濃度為100 μg/mL 時(shí)抑菌率也達(dá)73%;原花青素在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)抑菌率可達(dá)91%。其他單體在質(zhì)量濃度為200 μg/mL 時(shí)對(duì)MRSA 基本上無(wú)明顯的抑菌作用。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 11 株MRSA 對(duì)常見(jiàn)抗菌素的耐藥情況分析

表2 9 種中藥單體對(duì)11 株MRSA 的抑菌作用測(cè)定結(jié)果

殺菌作用:9 種具有抗MRSA 作用的中藥單體中只有2 種對(duì)MRSA 表現(xiàn)出一定的殺菌作用，分別為花旗松素和二氫楊梅素，且僅在質(zhì)量濃度為400 μg/mL 及以上才表現(xiàn)出殺菌作用。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 2 種中藥單體對(duì)11 株MRSA 的殺菌作用測(cè)定結(jié)果[殺菌株數(shù)(%)]

3 討論

中藥成分具有一定的抗MRSA 作用，但大多作用不強(qiáng)[5-6]。本研究中也從31 種中藥單體中發(fā)現(xiàn)了9 種對(duì)MRSA 有抑菌作用的中藥單體，其中花旗松素作用較強(qiáng)。但所篩選的31 種單體中僅有2 種具有一定的殺菌作用，但殺菌起效濃度較高，因此所發(fā)現(xiàn)的幾種天然單體直接的臨床應(yīng)用價(jià)值還不大，對(duì)其作進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾可能會(huì)提高其抑菌作用，因此有必要進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究開(kāi)發(fā)。

由于本研究中使用的MRSA 菌株數(shù)有限，用于計(jì)算最低抑菌濃度或半數(shù)抑菌濃度所得結(jié)果誤差會(huì)比較大，因此采用抑菌率和殺菌率來(lái)表示中藥單體的抗菌活性，結(jié)果更直觀、準(zhǔn)確。

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