李 飛，陳 羽

(1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110016;2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110016)

近年來(lái)，許多新發(fā)及再發(fā)傳染病對(duì)人類社會(huì)及人們的健康造成了極大威脅，研究及開(kāi)發(fā)高效安全的廣譜殺菌劑成為有效抗擊傳染病的重要途徑之一［1］。各種高效、低毒、安全的新型消毒劑相繼問(wèn)世，很多已經(jīng)應(yīng)用于臨床和家庭中。消毒藥物的廣泛使用，給人類的健康帶來(lái)了重要保證，但消毒效果與選用消毒劑的種類有著密切的關(guān)系。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外均致力于尋求高效、廣譜、快速的殺菌消毒劑［2］。醋酸氯己定，又名醋酸洗必泰，具有極強(qiáng)的廣譜抑菌、殺菌作用且毒性低，在生產(chǎn)生活中應(yīng)用廣泛。其主要作用機(jī)制是破壞病原微生物細(xì)胞壁原生質(zhì)膜，快速殺死革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、細(xì)菌芽胞、真菌及病毒等［3］。目前，市場(chǎng)上單純的醋酸氯己定產(chǎn)品并不多見(jiàn)，一般是其復(fù)配產(chǎn)品。鑒于醋酸氯己定屬于常用的消毒劑，在使用過(guò)程中，其消毒效果往往受到微生物的種類、溫度、濃度和pH值等因素的影響［4］。本文對(duì)醋酸氯己定的殺菌效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室研究，以便為將來(lái)合理開(kāi)發(fā)新型復(fù)配醋酸氯己定產(chǎn)品提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC 6538)、大腸埃希菌(Escherichia coli8099)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilisATCC 9372)、白假絲酵母菌(Canidia albicansATCC 10231)和黑曲霉(Aspergillius nigerATCC 16404)由沈陽(yáng)藥科大學(xué)微生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)教研室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，氯化鈉5.0，瓊脂粉14.0;沙堡瓊脂培養(yǎng)基:葡萄糖40.0，蛋白胨10.0，瓊脂粉14.0。

1.1.3 緩沖液(g/L) 標(biāo)準(zhǔn)硬水:CaCl20.304，MgCl20.139，用來(lái)配置待檢消毒劑;磷酸鹽緩沖液:Na2HPO42.83，KH2PO41.36，pH 7.2;中和劑:Na2S2O35.0，溶解于磷酸鹽緩沖液中，起中和消毒劑的殺菌作用。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 取5.0 mL磷酸鹽緩沖液加入已經(jīng)活化3代的新鮮斜面培養(yǎng)物試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。用移液管將洗液移至另一無(wú)菌試管中，用渦旋混合器振蕩20 s，使菌體懸浮均勻。初步制成的菌懸液，先用比濁測(cè)定法粗測(cè)其含菌濃度，然后用磷酸鹽緩沖液稀釋至1×1011～5×1011cfu/L之間。懸液可保存于4℃冰箱中備用，當(dāng)天使用不得過(guò)夜。菌懸液在使用時(shí)，應(yīng)先進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

1.2.2 芽胞懸液的制備 取已經(jīng)活化3代的B.subtilisATCC 9372液體培養(yǎng)物3 mL，接種于羅氏瓶中營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基表面，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)8 d。用接種環(huán)取菌樣少許，采用孔雀綠法進(jìn)行芽胞染色，并在顯微鏡下進(jìn)行鏡檢。當(dāng)芽胞形成率達(dá)95%以上時(shí)，即可進(jìn)行懸液的制備。用無(wú)菌水30 mL輕輕推刮下菌苔，集中于一含玻璃珠的無(wú)菌三角瓶中，振搖30 min，分散培養(yǎng)物，制成均勻的懸液。將盛裝上述懸液的三角瓶置于45℃水浴中24 h，使菌自溶斷鏈，分散成單個(gè)芽胞。最后，將三角瓶放于80℃水浴中10 min，以殺滅殘余的細(xì)菌繁殖體，待冷至室溫后，即為芽胞懸液。芽胞懸液可保存于4℃冰箱中備用，有效期為半年。芽胞懸液在使用時(shí)，應(yīng)先進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

1.2.3 黑曲霉孢子懸液的制備 用接種環(huán)劃線接種A.nigerATCC 16404于沙堡斜面培養(yǎng)基上，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。吸取體積分?jǐn)?shù)為0.05%的吐溫-80水溶液4 mL置于斜面表面，刮洗分生孢子，將孢子懸液移入裝有玻璃珠的三角瓶中，輕輕振搖30 min后，濾去菌絲。孢子懸液于4℃儲(chǔ)存，不能超過(guò)2 d，使用前混合均勻，并在顯微鏡下觀察，以孢子不萌發(fā)為宜。

1.2.4 消毒液的配置 取0.1 g醋酸氯己定(錦州九泰藥業(yè)有限責(zé)任公司)加入內(nèi)裝100 mL標(biāo)準(zhǔn)硬水的三角瓶中，混勻，即得0.1%醋酸氯己定消毒液。

1.2.5 中和劑的考察試驗(yàn) 設(shè)平行8組試驗(yàn)，以S.aureusATCC 6538為試驗(yàn)菌，按懸液定量殺菌試驗(yàn)程序進(jìn)行［4］。a.消毒液+菌懸液;b.(消毒液+菌懸液)+中和劑;c.中和劑+菌懸液;d.(消毒液+中和劑)+菌懸液;e.磷酸鹽緩沖液+菌懸液(正常菌對(duì)照);f.磷酸鹽緩沖液;g.中和劑;h.培養(yǎng)基。中和劑及其濃度的判定標(biāo)準(zhǔn):a組不長(zhǎng)菌或僅有極少數(shù)菌落生長(zhǎng);b組有菌落生長(zhǎng)，較a組多，但較c、d、e組少;c、d、e組菌落數(shù)分別在1×108～5×109cfu/L之間，且組間菌落數(shù)誤差率不應(yīng)超過(guò)15%;f、g、h組無(wú)菌生長(zhǎng)。借此可判定所選中和劑及其濃度適宜。

1.2.6 懸液定量殺菌試驗(yàn) 試驗(yàn)時(shí)，先將內(nèi)裝5 mL消毒液的試管置于20℃水浴中5 min，再將0.1 mL菌懸液加入其中，混勻，作用至規(guī)定時(shí)間。取0.5 mL菌藥混和液，移入4.5 mL中和劑溶液的試管中，混勻，中和作用10 min。取0.1 mL涂平板，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，活菌計(jì)數(shù)。以內(nèi)裝5 mL標(biāo)準(zhǔn)硬水的試管同步操作所得活菌數(shù)為基準(zhǔn)，計(jì)算殺菌率。

1.2.7 模擬現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn) 選擇木質(zhì)桌面，在桌面上劃定5 cm×5 cm范圍的2個(gè)不同區(qū)域，以涂抹法污染E.coli8099懸液(菌數(shù)為1×107cfu/L)，干燥后用棉拭在其中一個(gè)區(qū)域沾采樣液涂抹采樣作消毒前對(duì)照;然后將0.1%醋酸氯己定均勻噴涂在另一區(qū)域，作用10 min，以同樣方法進(jìn)行消毒后采樣;對(duì)消毒前后采樣液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，觀察殺菌效果，計(jì)算殺菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 中和劑的考察試驗(yàn)

經(jīng)檢測(cè)，用質(zhì)量濃度為0.5 g/L的Na2S2O3可有效中和0.1%醋酸氯己定的殺菌作用，中和劑及中和產(chǎn)物對(duì)受試菌及培養(yǎng)基無(wú)影響(見(jiàn)表1)。

2.2 醋酸氯己定的殺菌作用考察

采用懸液定量殺菌試驗(yàn)，考察0.1%醋酸氯己定對(duì)S.aureusATCC 6538、E.coli8099、B.subtilisATCC 9372、C.albicansATCC 10231和A.nigerATCC 16404的殺菌效果(見(jiàn)表2)。由表2可知，隨著作用時(shí)間的增加，0.1%醋酸氯己定起到了顯著的殺菌效果。

表1 消毒劑的中和劑試驗(yàn)Table1 The result of neutralizer test for the disinfectant

表2 醋酸氯己定的殺菌效果Table2 Germicidal efficacy of the chlorhexidine acetate

2.3 模擬現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)

用0.1%醋酸氯己定進(jìn)行模擬現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明:0.1%醋酸氯己定對(duì)E.coli8099懸液作用10 min，殺菌率為95.96%。說(shuō)明0.1%醋酸氯己定具有明顯的殺菌作用，為將來(lái)合理開(kāi)發(fā)新型中草藥復(fù)配醋酸氯己定產(chǎn)品提供技術(shù)支持。

3 討論

課題組對(duì)醋酸氯己定的殺菌消毒效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室研究，發(fā)現(xiàn)0.1%醋酸氯己定對(duì)某些細(xì)菌(S.aureusATCC 6538、E.coli8099)、細(xì)菌芽胞(B.subtilisATCC 9372)，某些酵母菌和曲霉菌(C.albicansATCC 10231、A.ninerATCC 16404)均起到了顯著的殺菌效果，為將來(lái)合理開(kāi)發(fā)新型、高效復(fù)配醋酸氯己定產(chǎn)品提供技術(shù)基礎(chǔ)。

醋酸氯己定是最常用的雙胍類化合物之一，具有相當(dāng)強(qiáng)的廣譜抑菌、殺菌作用，是一種較好的殺菌消毒劑。20世紀(jì)90年代初，醋酸氯己定在我國(guó)主要用作表面消毒防腐劑，其殺菌效力比市場(chǎng)常見(jiàn)的同類產(chǎn)品如苯扎溴銨、度米芬、潔消精、清毒凈等季銨鹽類陽(yáng)離子型表面活性劑效果都好，滲透力極強(qiáng)。即使在有血清、血液及其他分泌物的條件下，仍有很好的殺菌消毒效果。醋酸氯己定以毒性低、毒副作用小、無(wú)局部刺激作用、過(guò)敏反應(yīng)極少見(jiàn)等優(yōu)點(diǎn)，深受醫(yī)藥界的歡迎，其用量及使用范圍越來(lái)越大。

醋酸氯己定除了外用作消毒防腐劑外，在其他疾病的防治方面同樣具有顯著的效果，藥用范圍逐步擴(kuò)大。醋酸氯己定可以用作酒精代用品，效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于酒精。還可以用于飲用水消毒，預(yù)防腸道傳染病，治療細(xì)菌性痢疾、皮膚、咽喉、眼睛、口腔、耳、鼻、陰道、肛門等的真菌及細(xì)菌感染以及燒燙傷、凍傷和腋臭等。在食品方面，可以用作防腐劑，有用量少、成本低、保存時(shí)間長(zhǎng)、不影響口感、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)于當(dāng)前使用的同類產(chǎn)品。此外，醋酸氯己定還能用做日常生活中的消毒劑，如房間、衛(wèi)生間、餐具、家具、衣物等的消毒。隨著消毒劑的長(zhǎng)期使用，細(xì)菌對(duì)消毒劑耐藥性的逐年增加。因此，單純的醋酸氯己定產(chǎn)品并不多見(jiàn)，開(kāi)發(fā)新型醋酸氯己定復(fù)配系列產(chǎn)品，擴(kuò)展其應(yīng)用范圍，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。某些中草藥具有良好的殺菌效果，細(xì)菌、真菌等對(duì)其不易產(chǎn)生耐藥性，且中草藥的毒副作用相對(duì)較小。當(dāng)今世界共同聚焦食品和環(huán)境安全，開(kāi)發(fā)安全高效的中草藥復(fù)配消毒劑具有廣闊的市場(chǎng)前途［6］。

［1］高瓊，陳貴秋，李世康，等.三氯新與醋酸氯己定復(fù)方消毒液殺菌效果及毒性觀察［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，17(12):2500-2502.

［2］張冰，秦秀慧，李軍，等.戊二醛和季銨鹽復(fù)合消毒劑殺菌效果的試驗(yàn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2002，23(3):70-71.

［3］姚四新，劉保國(guó).洗必泰配制方法的改進(jìn)及其消毒效果［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2003，39(8):46-47.

［4］張冰，秦秀惠，李軍，等.戊二醛和季銨鹽復(fù)合消毒劑殺菌效果的試驗(yàn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2002，23(3):70-71.

［5］衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司.消毒技術(shù)規(guī)范［S］.北京，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，2002:9-200.

［6］劉富來(lái)，馮翠蘭.TS植物消毒劑消毒效果的初步研究［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2009，2:29-30.