黃 敏，鐘民濤

(大連醫(yī)科大學微生物學教研室，遼寧大連 116044)

香菇(Lentinula edodes)，是側耳科(Pleurotaccae)香菇屬的擔子菌，是全球人工種植最為普遍的食用菌［1］。近幾十年來國內外的研究者對多種食用真菌進行了深入的研究，發(fā)現食用真菌在預防、治療惡性腫瘤方面都具有重要的藥用價值。香菇作為主要藥用真菌具有健脾開胃、解毒化痰、提高免疫、抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展等作用［2］。大量的臨床病例證明，香菇多糖制劑在間接抑制殺傷腫瘤細胞，改善癥狀體征，減輕不良反應等方面都確實有效，因此香菇多糖制劑現已正式作為輔助化療藥物應用于臨床［3-5］。然而，對香菇中蛋白質生物學活性的研究以及從蛋白質水平去發(fā)掘其抗腫瘤活性的本質卻鮮有報道。我課題組多年來致力于香菇藥用價值的研究，發(fā)現香菇除多糖外還含有其他抗腫瘤成分:首次從多株香菇菌種中篩選得到1株香菇菌絲體的發(fā)酵液具有直接抗腫瘤、抗細菌作用［6-7］，因該菌株于1991年3月開始研究，故命名為C91-3，“C”代表“中國，China”。而后對該菌株發(fā)酵液進行了一系列后續(xù)研究證明:香菇C91-3發(fā)酵液粗蛋白能夠直接殺死多種腫瘤細胞，大大延長荷瘤動物的生存期且顯著改善其生存狀態(tài)，并發(fā)現其機制與誘導腫瘤細胞0凋亡有關［8-9］。目前研究熱點表明，尋找活性蛋白的編碼基因，克隆、表達及工業(yè)化生產抗新型腫瘤活性藥物顯得尤為重要。

1 香菇菌功能基因的研究現狀

目前，由于香菇基因組及轉錄組數據的缺乏，給香菇活性蛋白從基因水平上的研究帶來了困難。雖然NCBI網站在2006年就已經登記了香港大學正在進行香菇L-54菌株的基因組的測序工作，但至今仍然沒有發(fā)布香菇基因組。基因表達序列標簽(expressed sequence tags，EST)技術被認為是一種研究轉錄組的有效方法，已廣泛應用于新基因發(fā)現、基因表達分析和蛋白質組學［10-12］。目前香菇EST在GenBank中已有26 541條(截止4月23日，2012)，但大都沒有任何的相關功能注釋，并且這些EST數據都是通過傳統Sanger測序方法獲得的。盡管香港大學的Chum等［13］在2011年采用大規(guī)模cDNA的焦磷酸測序和Long-SAGE(Long Serial analysis of gene expression，SAGE)測序組合技術獲得了一些轉錄組序列，但僅限于在香菇子實體育種方面的研究，所以現有的數據尚不足以挖掘香菇的功能基因。

隨著基因組測序技術的不斷發(fā)展，越來越多的微生物基因組測序工作的完成，使基因的研究速度突飛猛進。隨著后基因組的興起，“組學”的方面研究成為日益研究的熱點。如轉錄組學，蛋白組學及代謝組學等。轉錄組是指特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉錄出來的所有RNA的總和，其中主要包括mRNAs，非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)和小RNA(small RNAs)。研究轉錄組對于解釋基因組的功能單位，解釋細胞和組織的分子成分，以及對于了解機體發(fā)育過程和疾病發(fā)生過程都是必要的。轉錄組研究是基因功能及結構研究的基礎和出發(fā)點，整個轉錄組分析的主要目標:對所有的轉錄產物進行分類;確定基因的轉錄結構，如其起始位點，5'和3'末端，剪接模式和其他轉錄后修飾;并量化各轉錄本在發(fā)育過程中和不同條件下(如生理/病理)表達水平的變化［14-15］。而整個轉錄組學研究是以測序技術的平臺為基礎。Sanger測序作為第一代的DNA測序方法應用的30多年來，對現代生物學研究起到了極大的促進作用。然而隨著大規(guī)模基因組學的興起，多種高通量低成本的測序技術應運而生，并逐步被應用到生物學研究的各個領域。目前，新一代測序技術(Next-generation Sequencing，NGS)核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列，近年來已經發(fā)展為主流的測序技術，而且有助于人們以更低廉的價格，更全面、更深入地分析基因組、轉錄組及蛋白質之間交互作用組的各項數據，這是Sanger測序無可比擬的。

2 新一代的測序技術平臺

新一代測序又稱作深度測序或高通量測序，是相對于傳統的Sanger測序而言，主要特點是測序通量高，測序時間和成本顯著下降。目前主要以Illumina公司的Solexa技術、ABI公司的SOLID技術和Roche公司的454技術為主要測序平臺。各平臺測序原理及技術特點比較見表1。

表1 主要高通量測序平臺的比較Table1 The comparison of major high-throughput sequencing technology

Solexa測序技術平臺是以單分子陣列原位擴增測序技術為核心的Illumina公司Solexa基因組分析儀(Illumina Solexa Genome Analyzer)，通過Solexa高通量測序技術進行轉錄組研究，可以大大降低測序所需時間和成本，并且可以獲得海量的數據，是目前使用最廣泛的新一代測序平臺，其特點為測序通量高;準確率≥98.5%，有效地解決了多聚重復序列的讀取問題;成本低于傳統Sanger測序技術的1%;可以進行Pair-end(PE)雙向測序。2008年以來，利用該技術開展的研究大幅度上升，報道文獻達400多篇(http://www.Illumina.com/systems/)。

Solexa測序原理是首先將細胞中的所有轉錄產物反轉錄為cDNA文庫，然后將cDNA文庫中的DNA隨機剪切為小片段(或先將RNA片段化后再反轉錄)，在cDNA兩端加上接頭再利用Solexa的Genome Analyzer測序儀進行雙末端(pairend)測序，將獲得reads進行拼接，將拼接后最終所得序列通過比對到參考基因組獲得該細胞的轉錄組信息，如釀酒酵母、擬南芥等轉錄組已成功采用Solexa測序技術獲得［16-17］，并在釀酒酵母中發(fā)現了487個新轉錄本，其中有一半用芯片技術沒有鑒定出來的［18］;若無參考基因組，則進行從頭組裝(de novo assembling)獲得的Unigene比對到各大基因及相關數據庫，根據序列同源性獲得該物種的轉錄組信息，如白粉虱轉錄組的獲得［19］。

3 香菇C91-3的轉錄組測序及數據分析

采用Solexa高通量測序技術首先應用到香菇C91-3轉錄組的研究中，對香菇C91-3轉錄組進行測序和從頭組裝(de novo)，并應用生物信息學方法對所得序列與多個蛋白數據庫(nr、Swiss-Prot、KEGG和COG)進行比對解析，試圖從功能基因組水平上研究香菇重要基因的表達。測序后獲得75 bp的reads數為57 998 508個，各項質量統計均說明測序質量良好。經從有組裝組裝后獲得Unigene數為28 923條，平均長度689 bp，具有編碼框的Unigene有18 120條。另外，測序隨機性結果表示所有reads隨機的覆蓋了Unigene的從5'到3'端的全長，說明測序覆蓋度與深度良好。轉錄組數據后續(xù)分析結果中GO功能分類顯示:共有2 853條Unigene分布到38個子功能分類中，可從宏觀上認識該物種的基因功能分布特征;在COG數據庫中預測有6 203條Unigene分布于25種功能分類中;KEGG的pathway分析結果顯示，所獲得unigene分布于各種pathway中，相當數量的功能基因同時參與到一種或幾種人類疾病與生命活動中［20］。

香菇C91-3大量的Unigene基因序列及其功能注釋信息的發(fā)現填補了香菇轉錄組的空白，并為從功能基因組水平上研究香菇活性蛋白的表達及其生物學功能的研究提供了基礎數據。

4 香菇C91-3功能基因的挖掘與開發(fā)現狀

現已證實香菇C91-3菌株發(fā)酵液粗提蛋白(LFP91-3)抗腫瘤作用是誘導腫瘤細胞凋亡，其機制可能與調控細胞周期有關［21］。所以以此為依據，首先篩選挖掘香菇C91-3菌株轉錄組Unigene的功能注釋中與細胞周期調控或細胞凋亡相關的功能基因，初步篩選出17個與細胞凋亡相關的功能基因的原始核苷酸序列及對應的翻譯后的蛋白質序列。為了形成自主的知識產權，將香菇轉錄組的基因命名，并已被GenBank接收，為Latcripin。源于香菇為真核生物，在真核表達系統中，選擇pPIC9K為表達載體，使其在畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115中進行目的基因表達，已成功克隆出Latcripin-1(GenBank Acession Number:JQ327159)，并證實它對人肺癌細胞A549具有誘導凋亡作用［22］。為了優(yōu)化表達條件，為未來工業(yè)化開發(fā)生產抗腫瘤藥物奠定基礎，選擇原核表達體系，以pET-32a為表達載體，將其在宿主菌Rosetta-gami(DE3)中誘導目的基因表達，Rosetta-gami(DE3)菌是1株可以高效表達真核源性基因的表達菌株，已成功克隆表達出6個Latcripin系列蛋白(GenBank Acession Number:KF772202、KF709447、KF682438、KF682439、KF682440、KF682441)，并鑒定出其抗腫瘤活性，同時已申報國家專利。

通過Solexa高通量新一代技術對香菇C91-3轉錄組的發(fā)現，為香菇C91-3的功能基因的挖掘和開發(fā)提供了基礎數據和新策略，同時也為應用生物技術方法獲得其他物種的活性蛋白的編碼基因提供了新的研究思路。

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