莫 芹，李騰云，沈 微*，樊 游，陳獻忠，王正祥，石貴陽

(1.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122;2.江南大學中國高校工業(yè)微生物資源數據平臺，江蘇 無錫 214122;3.福喜(威海)農牧發(fā)展有限公司，山東 乳山 264500)

淀粉酶是催化淀粉分子中α-1，4糖苷鍵或α-1，6糖苷鍵水解的一類水解酶。在常溫條件下，淀粉均以不溶于水的結晶顆粒形式存在，淀粉酶不能與淀粉分子接觸，因此不能起到水解淀粉的作用。當淀粉懸液加熱到較高溫度時，淀粉顆粒吸水膨脹，發(fā)生糊化現象，這時淀粉水解酶才可以充分接觸淀粉分子從而使淀粉水解。淀粉的糊化溫度一般在60℃以上，因此工業(yè)上使用的淀粉水解酶一般需要具有較高的耐熱性。溫泉是篩選耐熱細菌的寶庫，同時也是獲得耐熱型淀粉水解酶及其基因資源的寶庫。我國科學家對騰沖溫泉中耐熱細菌資源的多樣性及組成進行了詳細的研究，并從中篩選出大量有應用價值的耐熱型細菌［1-6］。云南省騰沖縣是我國溫泉資源最豐富的地區(qū)之一，擁有大小數百個溫泉。本文以騰沖縣臘幸村溫泉群中一個未經開發(fā)的小型溫泉為例，對其中具有淀粉降解能力的細菌進行分離鑒定，為進一步開發(fā)新型耐熱淀粉酶提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 云南省騰沖縣臘幸村一小型溫泉。

1.1.2 培養(yǎng)基 高溫菌培養(yǎng)基:酵母膏1 g，蛋白胨1 g，硫酸鎂0.1 g，硝酸鉀0.1 g，硝酸鈉0.69 g，磷酸鈉0.1 g，硫酸亞鐵0.002 g，微量元素溶液1 mL，瓊脂粉15 g，定容至1 L并調整pH至7;微量元素溶液:在2 L燒杯中加入900 mL純凈水，煮沸后冷卻至50℃以下，加入EDTA0.1 g充分溶解，依次加入硫酸錳0.05 g，硫酸銅0.02 g，六水硝酸鈷0.01 g，十水硼酸鈉0.02 g，鉬酸銨0.01 g，硫酸鋅0.096 g;淀粉-臺盼藍培養(yǎng)基:可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母膏2 g/L，NaCl 5 g/L，Trypan blue 0.1 g/L，pH 7.2～7.4。

1.2 方法

1.2.1 產淀粉酶高溫菌的篩選 稱取樣品懸浮于水中，適當稀釋后涂布于高溫菌培養(yǎng)基上，65℃培養(yǎng)24 h。選擇單菌落點種淀粉培養(yǎng)基平板，55℃培養(yǎng)48 h，觀察透明圈。根據菌落形態(tài)，挑取淀粉平板上不同形態(tài)透明圈的菌落，在淀粉培養(yǎng)基平板上劃線分離，55℃培養(yǎng)48 h，進一步觀察菌落周圍是否有透明圈。有透明圈的細菌初定為產淀粉酶細菌，斜面保存。

1.2.2 產淀粉酶細菌的分子鑒定 細菌染色體DNA的提取按文獻［7］介紹的方法進行。斜面上挑取1環(huán)菌體于50 μL無菌水中，混勻后加入100 μL裂解液，混勻，85℃保溫15 min即得到染色體DNA粗提液，離心后取1 μL直接用于后續(xù)PCR。細菌16S rDNA基因擴增方法如下:取200 μL PCR管1支，分別加入36.5 μL去離子水，10×Buffer 5 μL，dNTP 5 μL，引物P16sUP和P16sDW，各1 μL，Taq酶0.5 μL，上述染色體DNA粗提液1 μL。PCR程序:95℃ 5 min;95℃ 0.5 min，50℃ 1 min，72℃，1.5 min，30個循環(huán);72℃ 10 min。PCR反應引物序列:P16sUP:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';P16sDW:5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR產物送上海生工生物工程公司測序。利用美國國家生物技術信息中心的BLAST軟件將測序結果與GenBank收錄的序列進行同源性搜索比對。

1.2.3 淀粉酶發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基組成:玉米淀粉2%，豆餅粉2%，(NH4)2SO40.2%，CaCl20.01%。接種細菌斜面培養(yǎng)物1環(huán)于上述液體培養(yǎng)基中，55℃搖瓶培養(yǎng)48 h，檢測淀粉酶酶活。淀粉酶酶活的測定參照“中華人民共和國行業(yè)標準QB1805.1-93:2-淀粉酶活力的試驗方法”［8］進行。酶活定義:1 h液化1 g可溶性淀粉所需酶量為1個酶活力單位，以U/mL表示。

1.2.4 酶學性質的測定 分別配制pH 5～9(間隔0.5)的磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液，測定酶在不同pH緩沖液中的酶活力，以最高酶活為100%計算相對酶活確定酶的最適作用pH。在pH 8.5的磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液中，將酶液適當稀釋，分別在50～80℃(間隔10℃)條件下檢測酶活。以最高酶活力為100%計算相對酶活確定酶的最適反應溫度。

2 結果與分析

2.1 樣品初篩結果

所有樣品用生理鹽水適當稀釋后直接涂布LB以及pH為7和9的高溫菌培養(yǎng)基，65℃培養(yǎng)24 h。根據樣品稀釋情況推算每克樣品形成的菌落數，結果見表1。

表1 不同培養(yǎng)基樣品微生物菌落數量統(tǒng)計Table1 Colony counts of hot spring samples on different culture plates

由表1可見，LB培養(yǎng)基雖然是細菌通用培養(yǎng)基，但是對于高溫菌的培養(yǎng)效果不佳。在所研究的樣品中，只有溫泉底部沙土中有3株菌可以在24 h內形成菌落。本文所采集的水、沙土及腐殖質均為堿性，但在中性高溫菌培養(yǎng)基上形成的菌落數遠高于在pH 9的培養(yǎng)基上形成的菌落數，這說明自然界中嗜中性的細菌比較多。

2.2 降解淀粉細菌的篩選與鑒定

選擇上述平板上形態(tài)有差異的菌落，點種到淀粉-臺盼藍平板上，55℃培養(yǎng)48 h，觀察透明圈。結果顯示，在所選擇的共計約300個菌落中，大約有10%的菌落可以在淀粉-臺盼藍平板上形成透明圈。不同樣品獲得的菌落產生透明圈的情況見表2。

表2 樣品產淀粉酶菌落數量統(tǒng)計Table2 Colony counts of amylase producing bacteria in hot spring samples

由表2可見，從水樣中獲得的菌落數量少，且均不具有降解淀粉的能力。從菌落形態(tài)看，來源于水樣的細菌形成的菌落形態(tài)差異小，很可能來源于同一個或親緣關系接近的物種。在溫泉水底泥沙中獲得的菌落大約有8%具有降解淀粉的能力。腐殖質中獲得的菌落大約有1/3具有降解淀粉的能力。腐殖質中降解淀粉微生物含量高可能是這一環(huán)境中含有較多的淀粉等高分子有機物，具有這一類高分子分解能力的微生物具有生長優(yōu)勢。

2.3 降解淀粉細菌的分子生物學鑒定

將上述34株具有淀粉降解能力的細菌劃線分離，取單菌落進行16S rDNA基因序列分析。結果顯示，從腐殖質中獲得的25株菌的16S rDNA序列幾乎完全一致，將這些序列提交美國國家生物技術信息中心利用Blast軟件進行序列相似性搜索比對，結果顯示，25株菌均與Anoxybacillus flavithermus(NCBI登錄號:CP000922.1)最為接近，序列完全一致或僅有1～2個堿基差異。從菌落形態(tài)看，腐殖質樣品中細菌含量豐富，但所形成的菌落形態(tài)差異小，分子鑒定的結果同樣顯示，這個樣品中降解淀粉的細菌種類不多。沙土來源的9株菌的鑒定結果如表3所示。

表3 沙土樣品中降解淀粉細菌分子鑒定結果Table3 Molecular identification of bacteria which could degrade starch in heat soil samples

由表3可見，沙土樣品中降解淀粉細菌的種類比較豐富，篩選獲得的9株菌分別屬于7個種、3個屬。從樣品涂布平板后形成的菌落情況看，溫泉底部沙土中細菌的數量雖然不大，但是細菌種類非常豐富，主要表現為2個特點:一是菌落形態(tài)具有多樣性，二是在不同培養(yǎng)基上生長的細菌較多。分子鑒定的結果與根據菌落情況推測的結果一致。圖1為根據16S rDNA部分序列繪制的上述9株菌的分類與親緣關系。

圖1 溫泉沙土中產淀粉酶細菌的親緣關系Fig.1 Genetic relationships of amylase producing bacteria in heat soil samples of hot spring

2.4 部分細菌淀粉酶性質初步分析

根據細菌在淀粉-臺盼藍平板上形成透明圈的情況看，其中201、208、207、209四株菌在平板上形成的透明圈較大。其中207和209分別為嗜熱脂肪土芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌，國內外對這2種細菌的淀粉酶及其基因已經有很多研究。201和208兩株菌分別為熱葡糖苷酶地芽胞桿菌和黃熱厭氧芽胞桿菌。這2株菌的淀粉酶性質國內外均未見報道，因此本研究對這2株菌進行搖瓶發(fā)酵后對其淀粉酶性質進行了初步研究。201菌株搖瓶發(fā)酵48 h后發(fā)酵液酶活達到0.2 U/mL，208菌株酶活為0.3 U/mL。2株菌所產淀粉酶基本性質如圖2、圖3所示:201菌株淀粉酶最適溫度為70℃，在70～80℃范圍內酶活基本穩(wěn)定，最適pH為8，在pH 8～9范圍內酶活穩(wěn)定，是一種有較高耐熱性的堿性淀粉酶;208菌株淀粉酶最適反應溫度為60℃，最適pH為7，在pH 7～8范圍內酶活基本穩(wěn)定，是一種中性中溫淀粉酶。雖然上述2株菌均來源于pH 9的堿性環(huán)境，但其淀粉酶在pH 10的環(huán)境中酶活大部分喪失。

圖2 溫度對淀粉酶活力的影響Fig.2 Effects of temperature on the activity of amylase

圖3 pH對淀粉酶活力的影響Fig.3 Effects of pH on the activity of amylase

3 討論

本研究采用純培養(yǎng)技術從溫泉中篩選產淀粉酶的耐熱細菌。從培養(yǎng)結果看，采用高溫菌培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的細菌數量和種類均遠大于LB培養(yǎng)基，這表明改進培養(yǎng)方法對更好地開發(fā)溫泉細菌資源具有重要的作用。對溫泉不同部位微生物研究結果顯示，溫泉底部腐殖質和沙土中微生物種類和數量較大。李華蘭［3］等利用變性凝膠電泳(DGGE)方法對騰沖熱海大滾鍋和龍陵縣邦臘掌大沸泉中細菌進行分析發(fā)現，其底部細沙中存在豐富的原核生物多樣性。李沁元等［2］利用DGGE技術分析騰沖熱海三溫泉中細菌多樣性，發(fā)現溫泉中菌藻席和底部沉積物中細菌種類非常豐富。在近期的一項研究中，研究者采用454焦磷酸測序技術對騰沖縣熱海和瑞滇2個溫泉群的細菌群落進行了詳細的分析［9］。瑞滇溫泉群與本文采樣區(qū)臘幸溫泉群可能屬于同一溫泉群，該項研究結果顯示，瑞滇溫泉沉淀物中的細菌多樣性高于水體。本文采用微生物純培養(yǎng)技術進行研究，結論與上述研究者利用免培養(yǎng)技術獲得的結果相似，即溫泉中泥沙等固體上附著了大量微生物，并且具有豐富的細菌多樣性。溫泉底部沙土中微生物的數量比腐殖質中的少，但其微生物種類非常豐富，從沙土中篩選獲得的9株降解淀粉的細菌，分別屬于7個種，3個屬，各菌株間16S rDNA序列均有一定的差異。其中201號和208號2株菌分別為Geobacillus thermoglucosidasius和Anoxybacillus flavithermus，對其胞外淀粉酶進行初步分析，結果顯示2株菌所產胞外淀粉酶最適溫度分別為60和70℃，接近或超過淀粉糊化溫度，具有一定的應用潛力。

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