常超+馬治敏+伍金娥

摘要：為了研究布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）對菌群失調櫻桃谷肉鴨的修復作用，試驗采用單因子隨機分組設計，選取25只25日齡的健康櫻桃谷肉鴨分為正常對照組和抗生素組，正常對照組自由飲水，抗生素組按200 mL/只飲用添加氨芐青霉素（300 mg/L）的水10 d，成功建立菌群失調模型。對菌群失調組按不同劑量飼喂布拉氏酵母菌，連續(xù)飼喂15 d，觀察糞便中的菌群及血液學和免疫器官指數(shù)的恢復情況。結果表明，布拉氏酵母菌能成功修復菌群失調櫻桃谷肉鴨腸道中的大腸菌群、乳酸菌和雙歧桿菌，并可使其血液學指標和免疫器官指數(shù)恢復至正常水平。

關鍵詞：布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）；菌群失調；血液學指標；免疫器官指數(shù)

中圖分類號：S834；S816.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0627-04

由于抗生素作為促生長劑使用所引起的病原菌耐藥性、菌群失調及在動物性食品中的殘留等問題，世界上對取消飼用抗生素的呼聲越來越高[1]。事實上，不少國家已限制或禁止在飼料中使用青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、泰樂菌素、卡那霉素、慶大霉素等抗生素，對尚在使用的抗生素，特別是人畜共用的抗生素，也有嚴格的限制措施。國內外研究者紛紛致力于抗生素替代物的研究，各種飼料替代物層出不窮，代表性的替代物如微生態(tài)制劑、酶制劑、中草藥、低聚糖、糖萜素等。微生態(tài)制劑是在微生態(tài)學理論指導下，調整微生態(tài)失調，保持微生態(tài)平衡，提高宿主健康水平的正常菌群及其代謝產物和選擇性促進宿主正常菌群生長的物質制劑總稱[2]。近年來，隨著對微生態(tài)制劑的大量研究，微生態(tài)制劑產業(yè)快速發(fā)展起來。布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）是從印尼的荔枝（Litchi chinensis）果實中分離的，該菌株能在37 ℃的高溫下生長。研究發(fā)現(xiàn)，該菌能釋放有效的消化酶、提供優(yōu)質蛋白質和營養(yǎng)要素，提高宿主的免疫防御、消化和營養(yǎng)吸收能力；還能防治病原體，調節(jié)宿主免疫應答，減少炎癥等，抑制細菌毒素和增強營養(yǎng)要素的運輸 [3]。因此，利用酵母菌作為抗生素的替代物在動物養(yǎng)殖業(yè)使用理論上是可行的。本試驗通過建立抗生素引起的菌群失調的腹瀉模型，研究該菌對這一病理模型的修復作用，對指導酵母菌的合理應用，推動這一綠色飼料添加劑的發(fā)展具有重要實踐意義。

1 材料與方法

1.1 藥品與菌種

氨芐青霉素，購自武漢市華順生物技術有限責任公司；布拉氏酵母菌，法國百科大制藥廠生產。試驗時將布拉氏酵母菌分別配制成108 CFU/L（低劑量）、109CFU/L（中劑量）、1010 CFU/L（高劑量）菌懸液。

1.2 儀器與試劑

儀器：培養(yǎng)箱、滅菌鍋、全自動生化分析儀等；培養(yǎng)基：雙歧桿菌BS培養(yǎng)基、改良番茄汁培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，購自青島高科園海博生物技術有限公司。

1.3 試驗動物與分組

櫻桃谷肉鴨（1日齡），購自武漢市春江禽業(yè)有限責任公司。將25只櫻桃谷肉鴨隨機分成正常對照組（5只）、抗生素組（20只），飼養(yǎng)至25日齡開始建模試驗，正常對照組自由飲水，抗生素組按在飲水中添加抗生素的方式給藥，飲水中含氨芐青霉素量為300 mg/L，按200 mL/只限量飲水，飲完后自由飲水，連續(xù)飲用10 d。待菌群失調模型成功建立后開始修復試驗，將其分為4組（每組5只），即自然恢復組，低、中、高劑量布拉氏酵母菌組，分別作如下處理：各劑量布拉氏酵母菌組每天按200 mL/只飼喂不同劑量的布拉氏酵母菌菌懸液，飲完后自由飲水，自然恢復組自由飲水，各組連續(xù)飲用15 d。菌群失調模型成功建立后開始飼喂布拉氏酵母菌記為修復試驗的第一天。

1.4 飼養(yǎng)管理

按照常規(guī)肉鴨飼養(yǎng)方法，分0～3周齡和4～7周齡兩個時期飼養(yǎng)。飼料配方如表1所示。試驗前將鴨舍及附屬用具用福爾馬林和高錳酸鉀消毒，保持門窗完好、排水通暢，通風保溫性能好。全期籠養(yǎng)，自由采食。

1.5 檢測指標及測定方法

1.5.1 菌群數(shù)量的測定 從建模試驗開始后第二、五、九天早上9：00無菌采集每組鴨糞便標本各1.0 g，置于裝有玻璃珠及99 mL生理鹽水的三角瓶中混勻，然后連續(xù)10倍倍比稀釋至10-5，分別取10-3、10-4、10-5稀釋液各100 μL涂布于麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h用于檢測大腸菌群（Escherichia. coli）；用傾注法檢測雙歧桿菌（Bifidobacterium）和乳酸菌（Lactobacillus）：取1 000 μL稀釋液分別加至含有雙歧桿菌BS培養(yǎng)基、改良番茄汁培養(yǎng)基中，分散均勻，待培養(yǎng)基冷卻后置于37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h后測定。

1.5.2 血液指標的測定 于修復試驗開始前后測定，隨機采集抗生素組5只肉鴨的血液作為病理組的血液指標參數(shù)（病理對照組），飼喂布拉氏酵母菌后第15天分別采集正常對照組、飼喂布拉氏酵母菌各組肉鴨靜脈血2 mL（采血前禁食12 h，僅供飲水），用離心管收集血液，3 000 r/min離心15 min制備血清，分裝后于-20 ℃保存，送至武漢大學人民醫(yī)院采用全自動生化分析儀測定下列指標：肌酐（Cr）、葡萄糖（Glu）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、尿素（Urea）、總膽固醇（TCh）、甘油三酯（TG）。用以分析酵母菌對血液指標的修復情況以及對機體的損傷情況。

1.5.3 免疫器官指數(shù)的測定 于飼喂布拉氏酵母菌修復試驗的第15天對櫻桃谷肉鴨進行空腹活體稱重，采血后屠宰試驗鴨，將剔除周圍脂肪的胸腺、脾臟和法氏囊稱重，并按以下公式計算免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)=免疫器官質量（g）/活體質量（kg）

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)利用EXCEL進行整理，采用SSPS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，均值的多重比較采用Duncans法和LSD法，結果采用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 菌群失調模型的建立

按“1.3”試驗設計飼養(yǎng)，于建模試驗的第九天發(fā)現(xiàn)抗生素組發(fā)生腹瀉。櫻桃谷肉鴨糞便主要腸道菌群數(shù)量的檢測結果見表2。由表2可見，櫻桃谷肉鴨飲用氨芐青霉素的第九天，糞便中的大腸菌群、乳酸菌、雙歧桿菌與正常對照組相比差異均達到顯著水平（P<0.05），表明菌群失調模型建立成功，此時動物已經處于菌群失調的病理狀態(tài)。

2.2 布拉氏酵母菌對肉鴨菌群失調的調整

建模成功后停止飼喂氨芐青霉素，按“1.3”分組，飼喂不同劑量布拉氏酵母菌組于修復試驗的第三天和第15天分別取糞便測定各菌群的數(shù)量，以評價布拉氏酵母菌對菌群失調模型的修復情況，其結果見表3。由表3可以看出，在修復試驗的第三天，飼喂布拉氏酵母菌各組的大腸菌群、乳酸菌均達到正常水平，與正常對照組差異不顯著（P>0.05）；與正常對照組相比，飼喂布拉氏酵母菌各組雙歧桿菌的數(shù)量在3 d內雖未完全上升到正常水平，但均高于自然恢復組，結果表明飼喂布拉氏酵母菌有助于菌群的恢復。在修復試驗的第15天，飼喂布拉氏酵母菌各組大腸菌群均達到正常水平，與正常對照組相比差異不顯著（P>0.05）；飼喂不同劑量的布拉氏酵母菌后，糞便中乳酸菌、雙歧桿菌數(shù)量與正常對照組相比均呈上升趨勢（P<0.05）。

2.3 布拉氏酵母菌對肉鴨血清指標的影響

由表4可知，病理對照組Glu、TCh、TG、Cr均顯著低于正常對照組，而經飼喂不同劑量的布拉氏酵母菌后，上述指標均呈升高恢復的趨勢；除中劑量組的TCh和中、高劑量組的TG低于正常水平（P<0.05）外，其他指標各劑量組均恢復至正常水平。

2.4 布拉氏酵母菌對肉鴨免疫器官指數(shù)的影響

由表5可以看出，菌群失調的櫻桃谷肉鴨經高、中、低劑量的布拉氏酵母菌調整后，其胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)與正常對照組相比差異均不顯著（P>0.05），表明其恢復至正常水平；而自然恢復組脾臟指數(shù)未能達到正常水平，與正常對照組相比差異顯著（P<0.05）。

3 討論

3.1 菌群紊亂模型的建立

動物腸道微生態(tài)系統(tǒng)中存在著大量的不同種類的微生物，這些微生物之間及微生物與宿主之間有著錯綜復雜而又相對穩(wěn)定的關系。微生物和宿主之間的交互作用決定動物腸道中微生物群落的組成，宿主提供微生物棲息的場所，而微生物也提高了動物抵抗胃腸道感染的能力。在正常情況下，這些微生物之間存在著動態(tài)的平衡，但是如果受到外界因素如抗生素、激素、藥物和同位素的作用、環(huán)境的改變及疾病感染等，均可以導致動物腸道的微生態(tài)失調，即菌群失調[4]?？股氐氖褂貌划斠殉蔀橐鹁菏д{的最常見誘因[5]。根據(jù)菌群失調的概念制定了菌群失調的標準：動物體內常見的有益菌是雙歧桿菌與乳酸菌，最常見的條件致病菌是腸桿菌。微生態(tài)學的觀點認為菌群重度失調的表現(xiàn)為原來的菌群大部分被抑制，只有少數(shù)耐藥菌大量繁殖或者外來細菌占優(yōu)勢成為優(yōu)勢菌群所引起的感染。本試驗采用在飲水中添加氨芐青霉素給藥的方法，于試驗第九天檢測結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，糞便中的大腸菌群顯著增多，乳酸菌、雙歧桿菌顯著下降，表明建模成功。嚴梅楨等[6]給小鼠灌喂大量的大黃水煎液可引起小鼠腸道乳酸菌和雙歧桿菌顯著下降，造成小鼠腸道內菌群失衡。本試驗結果與上述研究結果一致。

3.2 布拉氏酵母菌對肉鴨血清學指標的影響

本試驗結果表明，菌群失調櫻桃谷肉鴨經布拉氏酵母菌調整后其血清中ALB、GLB、Glu、TCh、TG、Cr的含量均得以提升，大部分指標達到正常的櫻桃谷肉鴨血清中的含量（中劑量組的TCh和中、高劑量組的TG低于正常水平）。血清總蛋白包括血清中白蛋白和球蛋白，主要起維持血漿滲透壓、作為營養(yǎng)物質的運輸載體、保持組織蛋白動態(tài)平衡、修補組織、維持血液pH穩(wěn)定的生理作用，總蛋白水平反應機體的營養(yǎng)和免疫狀態(tài)。與菌群失調病理對照組相比，低劑量布拉氏酵母菌增加了肉鴨血清中的TP和ALB的含量，表明低劑量布拉氏酵母菌有助于改善氨芐青霉素造成的肉鴨免疫損傷狀態(tài)。血糖的來源渠道有腸道吸收、肝糖分解和糖的異生，機體內血糖含量的高低主要和腸道吸收能力有關，攝食量減少會導致血清葡萄糖的減少。本試驗中發(fā)現(xiàn)，在病理對照組血清中的Glu比正常對照組低，說明肉鴨攝食減少，血糖量不足，而通過一段時間的布拉氏酵母菌調整后，血糖水平上升，恢復至正常，其中高劑量的酵母菌升血糖的作用最強。血清中甘油三酯的降低可能說明肝臟脂肪合成減少，而調控脂肪合成的關鍵酶主要是乙酰輔酶A羧化酶（AAC）和脂肪合成酶（FAS）。Mohan等[7]研究發(fā)現(xiàn)益生菌能抑制肉雞血清中的膽固醇。本試驗結果表明，中劑量布拉氏酵母菌組與正常對照組相比在一定程度上降低了肉鴨血清中TCh和TG的含量，說明其增強了肉鴨機體的脂肪分解能力。臨床試驗表明，尿素氮、肌酐含量的升高提示試驗動物存在腎臟損傷的可能[8]。各劑量組與正常對照組相比，肉鴨血清中的Cr和Urea含量無顯著差異，提示布拉氏酵母菌對肉鴨腎臟不會造成損傷。

3.3 布拉氏酵母菌對肉鴨免疫機能的影響

鴨的免疫系統(tǒng)包括法氏囊、胸腺、骨髓、脾臟和淋巴結等。胸腺是細胞免疫的中樞器官，既可產生淋巴細胞又能合成和分泌胸腺激素；脾臟是禽類最大的外周免疫器官，在捕獲和處理抗原方面具有十分重要的作用，是T、B淋巴細胞尤其是B淋巴細胞增殖并產生免疫應答的場所；法氏囊是禽類特有的體液免疫器官，參與全身的細胞免疫和體液免疫[9]。微生態(tài)制劑能夠通過合成維生素、有機酸、氨基酸、醇類等物質來促進免疫器官的生長發(fā)育，同時微生物作為良好的免疫激活劑可促進動物免疫器官的生長和發(fā)育[10]。據(jù)研究，飼料中添加微生態(tài)制劑1 000 mg/kg，與對照組相比其法氏囊指數(shù)顯著提高（P<0.05）[11]。本試驗結果表明，與正常對照組相比，低、中劑量布拉氏酵母菌組胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)有提高，但無顯著差異。說明布拉氏酵母菌可以改善肉鴨的免疫機能，其中中劑量布拉氏酵母菌組的效果優(yōu)于低、高劑量布拉氏酵母菌組。

4 小結

本試驗連續(xù)在飲水中添加氨芐青霉素至第九天，發(fā)現(xiàn)抗生素組發(fā)生腹瀉，糞便中大腸菌群、乳酸菌與雙歧桿菌數(shù)量與正常對照組相比差異顯著，成功建立了菌群失調模型。對菌群失調肉鴨連續(xù)飼喂布拉氏酵母菌15 d，能使菌群失調櫻桃谷肉鴨腸道中的大腸菌群、乳酸菌和雙歧桿菌恢復至正常水平，并可使其血液學指標和免疫器官指數(shù)恢復至正常水平，表明布拉氏酵母菌對菌群失調櫻桃谷肉鴨可起到修復作用。

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4 小結

本試驗連續(xù)在飲水中添加氨芐青霉素至第九天，發(fā)現(xiàn)抗生素組發(fā)生腹瀉，糞便中大腸菌群、乳酸菌與雙歧桿菌數(shù)量與正常對照組相比差異顯著，成功建立了菌群失調模型。對菌群失調肉鴨連續(xù)飼喂布拉氏酵母菌15 d，能使菌群失調櫻桃谷肉鴨腸道中的大腸菌群、乳酸菌和雙歧桿菌恢復至正常水平，并可使其血液學指標和免疫器官指數(shù)恢復至正常水平，表明布拉氏酵母菌對菌群失調櫻桃谷肉鴨可起到修復作用。

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4 小結

本試驗連續(xù)在飲水中添加氨芐青霉素至第九天，發(fā)現(xiàn)抗生素組發(fā)生腹瀉，糞便中大腸菌群、乳酸菌與雙歧桿菌數(shù)量與正常對照組相比差異顯著，成功建立了菌群失調模型。對菌群失調肉鴨連續(xù)飼喂布拉氏酵母菌15 d，能使菌群失調櫻桃谷肉鴨腸道中的大腸菌群、乳酸菌和雙歧桿菌恢復至正常水平，并可使其血液學指標和免疫器官指數(shù)恢復至正常水平，表明布拉氏酵母菌對菌群失調櫻桃谷肉鴨可起到修復作用。

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