高 超張 浩靳 峰

伊立替康與順鉑對U-87MG細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

高 超1張 浩2靳 峰2

目的 通過順鉑及伊立替康對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U-87MG進(jìn)行體外藥敏實驗，研究其對腫瘤細(xì)胞抑制作用的差異。方法 采用U-87MG細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞使用10種不同濃度的順鉑、伊立替康進(jìn)行處理，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化，CTG試劑盒檢測各組細(xì)胞增殖情況。結(jié)果 順鉑與伊立替康對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U-87MG生長抑制作用在一定范圍隨藥物濃度增加而增強(qiáng)，除100μg/m l濃度組外，各比較之間對細(xì)胞生長抑制作用存在著顯著差異。結(jié)論 順鉑與伊立替康對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U-87MG增殖均有明顯的抑制作用，且與藥物濃度成正相關(guān)性，伊立替康殺滅腫瘤細(xì)胞的作用優(yōu)于順鉑。

U-87MG細(xì)胞系；細(xì)胞周期；細(xì)胞增殖；順鉑；伊立替康

腦膠質(zhì)瘤是原發(fā)性腦腫瘤中發(fā)病率最高且預(yù)后最差的腫瘤，約占原發(fā)性腦腫瘤的35.26%～60.69%（平均44.69%）[1]，其腫瘤細(xì)胞呈彌漫浸潤性生長，具有高復(fù)發(fā)率、高病死率、低治愈率的特點。目前腦膠質(zhì)瘤的臨床常規(guī)治療多以手術(shù)切除為主，因為腫瘤組織對化療藥物存在不同程度的耐藥性，術(shù)后化療效果往往不理想。本文通過伊立替康與順鉑對U87-MG腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行體外藥敏實驗，比較藥物優(yōu)缺點，以期為膠質(zhì)瘤的臨床化療提供更多選擇。

1 資料與方法

1.1 材料和試劑 順鉑、伊立替康、EDTA和二甲基亞砜DMSO購自美國Sigma公司；U-87MG人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院外科學(xué)教研室惠贈；特級胎牛血購自杭州四季青公司；DMEM/F12培養(yǎng)基（1:1粉劑）、Trizol、胰蛋白酶購自美國Invitrogen公司；CellTiter-Glo?螢光素酶試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾公司），超凈工作臺SW-U-2FP（上海博迅有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡（日本Olympus公司），培養(yǎng)板（96孔E&K Scientific EK-25075）（美國Turner公司），Modulus微孔板多功能檢測儀（9300-002）（美國Turner公司），流式細(xì)胞儀：BD LSRⅡ型（Becton Dickinson，美國）。

1.3 方法

1.3.1 U-87MG人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株培養(yǎng)與傳代 棄去原培養(yǎng)液，采用0.25%胰蛋白酶消化后，將其移至離心管低速離心，棄上清液加新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，反復(fù)吹成單細(xì)胞，取樣行臺盼藍(lán)染色、活細(xì)胞數(shù)計數(shù)，以2×105活細(xì)胞/m l終濃度接種于培養(yǎng)瓶，在37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～4d換液，每7天傳代一次。

1.3.2 U-87MG人膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 根據(jù)細(xì)胞增殖情況，將其在倒置相差顯微鏡下觀察，比較不同濃度藥物處理組及空白組處理后的細(xì)胞形態(tài)、大小及細(xì)胞群生長情況，并照相。

1.3.3 CellTiter-Glo?螢光素酶試劑盒檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)期生長U-87MG細(xì)胞置于96孔培養(yǎng)板上，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基制成100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.390625、0.1953125μg/m l濃度的順鉑、伊立替康制劑，然后對培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞分別進(jìn)行處理，使用空細(xì)胞作為對照，使用未加入化療藥物的細(xì)胞培養(yǎng)孔作為陰性對照，在每個細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入100μl CellTiter-Glo檢測試劑，然后在室溫下孵育10m in以穩(wěn)定發(fā)光，將96孔培養(yǎng)板放入微孔板多功能檢測儀進(jìn)行檢測，將結(jié)果保存。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞周期與凋亡 將對數(shù)期生長U-87MG以106接種于60mm培養(yǎng)皿，過夜培養(yǎng)。加入IC50的順鉑（12.05μg/m l）、伊立替康（2.75μg/m l）及相應(yīng)的溶劑對照，孵育24h。以胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗兩遍，加入1m l 70%預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4℃固定過夜。磷酸鹽緩沖液洗滌去乙醇，并重懸細(xì)胞，加入碘化丙啶和 RNaseA至終濃度50g/m l，37℃ 溫浴30min。用流式細(xì)胞儀測定周期。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計處理使用SPSS 10.0 for w indows統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 順鉑與伊立替康在100mg/m l濃度時處理U-87MG細(xì)胞72h相差顯微鏡所見（圖1），陰性對照細(xì)胞生長密集，光澤度好；順鉑細(xì)胞密度均較陰性對照低，已出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的特征，細(xì)胞數(shù)減少，稀疏，腫脹變形，細(xì)胞變小變圓，出現(xiàn)核碎裂、固縮現(xiàn)象，尤以伊立替康明顯。

圖1 A：陰性對照（5×10倍），B：順鉑（5×10倍），C：伊立替康（5×10倍）

2.2 本實驗研究表明，順鉑與伊立替康對U-87MG的生長抑制作用隨藥物濃度增加而增強(qiáng)。經(jīng)各濃度兩相比較q檢驗表明（表1），除100mg/m l濃度，各比較之間對細(xì)胞生長抑制作用均存在差異性，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)圖2顯示，IC50時對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，伊立替康實際藥物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于順鉑實際藥物濃度（2.75mg/m l＜12.05mg/m l）。

表 1 兩藥各濃度時樣本均數(shù)比較的q檢驗

圖 2 10種濃度持續(xù)作用48h對U-87MG細(xì)胞生長抑制作用

2.3 如圖3所示，與陰性對照相比，藥物處理后的U-87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期均出現(xiàn)明顯變化，經(jīng)順鉑處理后，G0/G1期細(xì)胞數(shù)由42.13%增加至62.34%，S期細(xì)胞數(shù)由33.77減少至20.94%；經(jīng)伊立替康處理后，G0/G1期細(xì)胞數(shù)由42.13%增加至52.03%，S期細(xì)胞數(shù)由33.77減少至18.58%。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，呈彌漫性浸潤性生長，高度侵襲性，沒有明確邊界。術(shù)后化療是治療腦膠質(zhì)瘤的重要環(huán)節(jié)，但是由于對化療藥物不敏感、血腦屏障，特別是耐藥機(jī)制的存在，嚴(yán)重影響了化療的效果。雖然替莫唑胺的發(fā)明是膠質(zhì)瘤化療過程中的一個里程碑，但由于MGMT、ERCC1等耐藥基因的存在，特別是研究表明，其在全部膠質(zhì)瘤實驗標(biāo)本的陽性表達(dá)大約在50%[2-3]，在這些陽性病例患者中的化療效果并不優(yōu)于鉑類，其經(jīng)濟(jì)性更遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于鉑類藥物。所以，能否以基礎(chǔ)化療藥物順鉑為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出化療效果顯著，毒副作用低，而經(jīng)濟(jì)性又可被廣泛接受的藥物，成為臨床化療工作中急切要解決的問題，本實驗就選擇伊立替康與順鉑進(jìn)行體外藥敏對比實驗。

圖 3 FCM檢測IC50濃度組處理U87MG細(xì)胞24h后增殖周期的變化

回顧歷史，20世紀(jì)60年代，Rosenberg在使用鉑電極在含有氯化銨的大腸桿菌培養(yǎng)液通電時，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌就不在生長而是長成菌絲，如果換成其它電極就沒有該現(xiàn)象，經(jīng)進(jìn)一步研究證實是電極溶解出的鉑與培養(yǎng)基中NH3和Cl生成順式二氯二氨合鉑（簡稱順鉑）起的作用，從此揭開金屬配合物抗癌研究的序幕[4]。順鉑屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，作用類似雙功能烷化劑，使DNA受損而發(fā)揮作用。羥基喜樹堿是我國從珙桐科植物喜樹中提取得到的純天然抗癌藥，屬于喜樹堿（CPT）類藥物，直到1985年證明其特殊靶點DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，從而設(shè)計了高效、水溶性好的喜樹堿類似物，才應(yīng)用于臨床，伊立替康（CPT-11）就是其中之一[5]。伊立替康是通過阻斷拓?fù)洚悩?gòu)酶與DNA反應(yīng)的最后一步，即它進(jìn)入胞內(nèi)，與Topo-DNA復(fù)合物結(jié)合成Topo-藥物-DNA復(fù)合物，抑制DNA重連，導(dǎo)致DNA鏈的斷裂，使細(xì)胞凋亡[6]。

該實驗中使用順鉑及伊立替康10種梯度濃度對U-87MG細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，結(jié)果表明，對腫瘤細(xì)胞生長抑制作用均呈濃度依賴性，隨濃度升高而抑制作用增強(qiáng)，除100mg/m l濃度組外，對細(xì)胞生長抑制作用均存在差異性，證明伊立替康作用效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于順鉑。特別是使用2.75mg/m l濃度伊立替康能達(dá)到與12.05mg/m l順鉑抑制半數(shù)腫瘤細(xì)胞一樣的效果。這一點在具體臨床工作中，使伊立替康擁有巨大優(yōu)勢，避免了像順鉑一樣導(dǎo)致機(jī)體的肝腎毒性、耳毒性和嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)等藥物毒副作用。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，經(jīng)順鉑處理的腫瘤細(xì)胞G0/G1期數(shù)目由42.13%增加至62.34%，S期細(xì)胞數(shù)由33.77減少至20.94%，證實可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞被阻滯于S期，主要作用機(jī)制是其能與DNA產(chǎn)生交聯(lián)，或形成DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，導(dǎo)致DNA斷裂或誤碼，使有絲分裂受到抑制。但是順鉑有本身先天性缺陷，首先是其不易溶解，化學(xué)穩(wěn)定性較差，影響了其療效的發(fā)揮；其次ERCC1、MGMT的存在，使受到鉑類化合物攻擊受損的DNA得到修復(fù)，是影響其療效的一個重要原因。流式細(xì)胞學(xué)分析，經(jīng)伊立替康處理后的腫瘤細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞數(shù)由42.13%增加至52.03%，S期細(xì)胞數(shù)由33.77%減少至18.58%，表明腫瘤細(xì)胞周期被阻止在S期，證明形成的Topo-藥物-DNA復(fù)合物阻止DNA的復(fù)制，使細(xì)胞出現(xiàn)周期停滯，為細(xì)胞周期S期特異性藥物。CPT-11作為喜樹堿類半合成衍生物，具有獨特的分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制，CPT-11作為Topo1抑制劑并不阻礙Topo1的結(jié)合，而是將這種酶轉(zhuǎn)變成對DNA有害物質(zhì)，即Topo1濃度越高，對藥物越敏感。

分析以上實驗結(jié)果，伊立替康不但在濃度抑制上有優(yōu)勢，避免了化療藥物高濃度引起的各種毒副作用，而且以其獨特的作用機(jī)制，又避免了耐藥基因?qū)κ軗pDNA的修復(fù)，決定了其獨特的臨床益處，起到了良好的化療效果，為臨床攻克膠質(zhì)瘤化療耐藥治療難題提供更多的藥物選擇。

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R734.2

A

1673-5846(2014)06-0246-03

1山東省汶上縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科，山東濟(jì)寧 272500

2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，山東濟(jì)寧 272500