衛(wèi) 強(qiáng)， 徐 飛， 邱 鎮(zhèn)， 紀(jì)小影

（安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088）

菊葉總黃酮抗腫瘤作用初步研究

衛(wèi) 強(qiáng)， 徐 飛， 邱 鎮(zhèn)， 紀(jì)小影

（安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088）

本文以MTT法考察菊葉中總黃酮的體外抗腫瘤活性；以小鼠移植瘤模型測定總黃酮對荷瘤小鼠抑瘤率和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力，研究其體內(nèi)抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用.結(jié)果表明，總黃酮對S180細(xì)胞生長有顯著抑制作用.體內(nèi)試驗(yàn)表明，與生理鹽水組相比，總黃酮對小鼠S180實(shí)體瘤有顯著抑制作用（P＜0.01），抑瘤同時可促進(jìn)體重增長；總黃酮高劑量組可提高荷瘤小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù).與環(huán)磷酰胺組和生理鹽水組比較，總黃酮可使荷S180實(shí)體瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力升高，表明其對小鼠沒有免疫抑制作用.

菊葉；總黃酮；抗腫瘤

安徽菊花道地藥材有“亳菊”、“滁菊”、“貢菊”三種，具有清熱明目之效[1].菊葉為植物菊花的莖上葉，有治療瘡、癰疽、頭風(fēng)、目眩的功效[2]，菊葉提取物有抗菌、保護(hù)心肌缺血、抗氧化的作用.菊葉中主要含有黃酮類、揮發(fā)油、綠原酸三種成分[3].

國內(nèi)研究表明，黃酮類化合物已成為新的抗腫瘤研究熱點(diǎn)，目前已發(fā)現(xiàn)多種植物提取物中黃酮類成分有抗腫瘤活性，如雞血藤黃酮類成分可抑制乳腺癌細(xì)胞生長[4]，木瓜總黃酮對死亡因子（PD）-1與其配體（PD-L1）的結(jié)合有抑制作用，使腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)降低而促進(jìn)機(jī)體對腫瘤的免疫應(yīng)答，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用[5].萬壽菊莖葉中兩種黃酮類化合物4'-甲氧基-澤蘭素3-O-β-D-葡萄糖苷和山柰酚-3,7-O-α-L-雙鼠李糖苷均可抑制人胃癌細(xì)胞SGC7901和人肝癌細(xì)胞SMMC7721的增殖，且呈現(xiàn)濃度與時間依賴性[6].黃明玉等[7]研究山茶花總黃酮抑制小鼠H22肝癌移植瘤生長，結(jié)果顯示，總黃酮高、中劑量組可明顯降低瘤體重量，顯著增加小鼠脾和胸腺指數(shù)，顯著提高巨噬細(xì)胞吞噬功能和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力.本論文擬對菊葉中總黃酮的抗腫瘤作用進(jìn)行初步研究，以期為其開發(fā)應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與藥品

菊葉，來自安徽滁州地區(qū)；瘤株S180，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫提供；MTT（噻唑藍(lán)）、環(huán)磷酰胺，購于美國Sigma公司；其它試劑均為分析純.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性小鼠，體質(zhì)量18-22g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號:皖醫(yī)實(shí)動準(zhǔn)字01號.

1.1.3 儀器與設(shè)備

SAFEDA MB-601型全自動酶標(biāo)儀，北京賽必達(dá)科技有限公司；UV-4802S型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；CHP型CO2培養(yǎng)箱，常州普天儀器制造有限公司；Leica XDS-200倒置顯微鏡，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司.

1.2 方法

1.2.1 菊葉總黃酮的提取[8]

稱取菊葉粗粉20g，加入50%乙醇600ml回流提取時間3次（2h，1h，0.5h），抽濾，提取液濃縮至小體積，加水和石油醚萃取3次，將水液濃縮，備用.

1.2.2 菊葉總黃酮的純化[9]

稱取8g經(jīng)預(yù)處理的X-5型大孔樹脂，用水溶液裝柱（2.5cm×30cm）.量取供試液3mL加入相同量的聚酰胺，水浴蒸干后置于前面樹脂柱中，水洗至無色.再以70%乙醇洗脫至125mL.提取液量（mL）與聚酰胺量（g）比例為1.5:1，樹脂(g)-提取液(mL)為4:3，色譜柱徑高比1:20，洗脫液收集量為2BV，得總黃酮（純度80.1%）.

1.2.3 瘤細(xì)胞懸液制備

選擇接種后8d健康的S180種鼠，頸椎脫臼，固定于蠟板上，腹部皮膚消毒后，剪開并剝?nèi)ジ共科つw，用空針穿過腹部肌肉，無菌獲取的腹水，以生理鹽水稀釋成腫瘤細(xì)胞懸液（濃度106個/mL）.

1.2.4 抗腫瘤試驗(yàn)（MTT法）

將1.2.1項(xiàng)下S180細(xì)胞懸液接種于96孔板，保持每孔100μL.設(shè)菊葉總黃酮組、空白組、陰性對照組三個組別，每組6個復(fù)孔.接種后，在5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)和37℃下培養(yǎng)，過夜，貼壁或離心后，對照組換液、藥物組加入20、40、100、200、500mg/L的總黃酮培養(yǎng)液各60μL，培養(yǎng)48h后以MTT法檢測細(xì)胞活力[10-11].每孔加入MTT液（3g/L）8μL，3h后，吸取培養(yǎng)液，加入120μL二甲基亞砜，在波長490nm處以酶標(biāo)儀測定吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞生長的抑制率.

1.2.5 對小鼠S180實(shí)體瘤生長和免疫器官的影響

選取60只ICR小鼠作為試驗(yàn)動物，將含106個/mL的S180細(xì)胞懸液接種到小鼠右前肢腋窩下，0.3mL/只.24h后，將小鼠隨機(jī)分成生理鹽水組、環(huán)磷酰胺組（22mg/kg）、菊葉總黃酮高、中、低三個劑量組（500、300、100mg/kg），共5組，每組12只.次日開始接種，隔日腹腔注射環(huán)磷酰胺，每日連續(xù)灌胃給予總黃酮.每日記錄小鼠體重，觀察并記錄小鼠死亡時間.14d后脫頸椎處死小鼠，根據(jù)瘤塊計(jì)算抑瘤率，根據(jù)胸腺和脾臟計(jì)算臟器指數(shù)[12].

1.2.6 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

動物分組及給藥方法同“1.2.3”.小鼠處死后腹腔注射RPMI 1640培養(yǎng)液約3mL，收集腹腔液，離心2min（2500r/min），棄去上清液，以培養(yǎng)液調(diào)到每升含2×109個細(xì)胞.將巨噬細(xì)胞懸液接種于96孔板，保持每孔100μL，置5%CO2培養(yǎng)箱和37℃下培養(yǎng)4h，除去上清液，每孔加入50μL 0.2%中性紅溶液，培養(yǎng)30min.取出培養(yǎng)板，以磷酸鹽緩沖液數(shù)次沖洗，每孔加入100μL細(xì)胞裂解液，于570nm處進(jìn)行可見-紫外分光光度計(jì)測定吸收度值[13-14].

1.2.7統(tǒng)計(jì)和分析

采用Cochran&Cox近似t檢驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

圖1 菊葉總黃酮對S180細(xì)胞的抑制作用

2.1 體外對腫瘤細(xì)胞存活的抑制作用

如圖1所示，菊葉總黃酮質(zhì)量濃度與S180細(xì)胞存活的抑制有相關(guān)性，在濃度高于200mg/L時，對S180細(xì)胞抑制作用明顯；在600mg/L時最高，抑制率為82.2%.

2.2 對S180荷瘤小鼠的影響

結(jié)果見表1和表2.

表1 菊葉總黃酮對S180荷瘤小鼠體重和抑瘤率的影響（n=12，±SD）

表1 菊葉總黃酮對S180荷瘤小鼠體重和抑瘤率的影響（n=12，±SD）

注：與生理鹽水組相比，aP＜0.05，bP＜0.01；與環(huán)磷酰胺組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量（mg/kg） 體重增加量（g） 瘤重（g） 抑瘤率生理鹽水組 15.71±2.09 1.99±0.21△△環(huán)磷酰胺組 20 15.01±3.08 0.92±0.26b 53.77總黃酮低劑量組 100 16.92±2.76 1.34±0.25b△△ 32.66總黃酮中劑量組 300 18.22±3.03a△ 1.21±0.36b△ 39.20總黃酮高劑量組 500 18.65±2.71a△ 1.05±0.37b 47.23

表2 菊葉總黃酮對S180荷瘤小鼠免疫器官的影響（n=12，±SD）

表2 菊葉總黃酮對S180荷瘤小鼠免疫器官的影響（n=12，±SD）

注：與生理鹽水組相比，aP＜0.05，bP＜0.01；與環(huán)磷酰胺組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

胸腺指數(shù)（mg/g）生理鹽水組 4.26±0.56 1.32±0.36環(huán)磷酰胺組 20 4.31±0.72 1.44±0.38總黃酮低劑量組 100 5.12±0.83a△ 1.52±0.29總黃酮中劑量組 300 5.46±0.91b△△ 1.61±0.37總黃酮高劑量組 500 5.71±0.68b△△ 1.70±0.42a組別 劑量（mg/kg）脾指數(shù)（mg/g）

由表1可知，與生理鹽水組相比，不同劑量的菊葉總黃酮均可顯著抑制S180實(shí)體瘤的生長（P＜0.01），有劑量相關(guān)性；菊葉總黃酮高劑量組抑瘤率達(dá)到47.23%，略低于環(huán)磷酰胺對照組.總黃酮低劑量組與環(huán)磷酰胺組抑瘤率比較有顯著性差異（P＜0.01）.總黃酮高、中、低劑量組在促進(jìn)小鼠體重增長上與生理鹽水組、環(huán)磷酰胺組相比均顯示較顯著性差異（P＜0.05）.由表2可知，環(huán)磷酰胺可明顯抑制S180實(shí)體瘤的生長，但對提高小鼠免疫器官的免疫功能能力不顯著.與環(huán)磷酰胺組比較，菊葉總黃酮高劑量組可使小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)較顯著的增加（P＜0.05），表明其在抑瘤與增強(qiáng)荷瘤小鼠免疫功能方面有一定相關(guān)性.

2.3 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響結(jié)果見表3.

表3 菊葉總黃酮對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響（n=12，±SD）

表3 菊葉總黃酮對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響（n=12，±SD）

注：與生理鹽水組相比，bP＜0.01；與環(huán)磷酰胺組相比，△△P＜0.01

組別 劑量（mg/kg） 吸光值生理鹽水組 0.438±0.057環(huán)磷酰胺組 20 0.412±0.078總黃酮低劑量組 100 0.546±0.034b△△總黃酮中劑量組 300 0.592±0.059b△△總黃酮高劑量組 500 0.613±0.066b△△

由表3可知，與生理鹽水組相比，環(huán)磷酰胺組可使小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力降低5.94%，表明其對S180實(shí)體瘤小鼠免疫功能有明顯抑制作用.與生理鹽水組相比，菊葉總黃酮高、中、低劑量組可使腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力顯著升高（P＜0.01），分別增加39.95%、35.16%和24.66%.

3 結(jié)論與討論

菊葉資源蘊(yùn)藏量豐富，據(jù)統(tǒng)計(jì)，貢菊和杭菊每年有5000噸左右[15]的產(chǎn)量.從產(chǎn)量上來說，菊葉比菊花大得多.由于菊葉不能直接作為藥用，菊花被采集時，菊葉被大量廢棄.根據(jù)對滁菊花提取工藝研究結(jié)果，滁菊花中總黃酮的平均含量為6.70%[16]，滁菊葉中總黃酮的平均含量為10.06%[8].可見，菊葉中黃酮成分相對菊花有明顯的含量優(yōu)勢，有較高的開發(fā)利用價值.

本實(shí)驗(yàn)以MTT法證明菊葉總黃酮對S180細(xì)胞生長有顯著抑制作用，在質(zhì)量濃度達(dá)到600mg/L時最高，抑制率為82.2%.實(shí)驗(yàn)建立了小鼠移植瘤模型，通過測定菊葉總黃酮對荷瘤小鼠抑瘤率和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力，證明了總黃酮對小鼠S180實(shí)體瘤有顯著抑制作用，抑制腫瘤生長同時，可明顯提高小鼠體重.菊葉總黃酮高劑量組可提高荷瘤小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)；通過與環(huán)磷酰胺組和生理鹽水組比較，證實(shí)菊葉總黃酮可使荷S180實(shí)體瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力顯著升高，表明其沒有免疫抑制作用.

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R285；R979.1

A

1673-260X（2014）10-0072-03

安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2013B103）;國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201312216028，201312216029）；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目 （AH 201312216001）；安徽省質(zhì)量工程項(xiàng)目 （2013gxk105）；安徽新華學(xué)院質(zhì)量工程項(xiàng)目（2013gxkcx01）