王磊峰，董玉萍，朱素芳，李曉娟，董秋艷，黑 硯

淚腺腺樣囊性癌S-100蛋白、神經(jīng)細(xì)絲酸性蛋白的表達(dá)及其意義

王磊峰1，董玉萍1，朱素芳1，李曉娟1，董秋艷1，黑 硯2

目的 探討淚腺腺樣囊性癌S-100蛋白及神經(jīng)細(xì)絲酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein， GFAP)的表達(dá)及其意義。方法 收集手術(shù)切除淚腺腺樣囊性癌28例標(biāo)本，根據(jù)臨床癥狀及組織學(xué)觀察分為嗜神經(jīng)侵襲組(15例)和無(wú)嗜神經(jīng)侵襲組(13例)，并取術(shù)中切除的正常淚腺組織9例為正常對(duì)照。應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP染色法檢測(cè)S-100及GFAP在上述組織中表達(dá)的差異。結(jié)果 嗜神經(jīng)侵襲性生長(zhǎng)組的S-100、GFAP陽(yáng)性表達(dá)分別為12例(80%)和9例(60%)，與無(wú)嗜神經(jīng)侵襲性生長(zhǎng)組S-100陽(yáng)性5例(41.67%)、GFAP 陽(yáng)性表達(dá)率為0相比，呈顯著升高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。結(jié)論 GFAP、S-100在有嗜神經(jīng)性侵襲的腺樣囊性癌中有特異性表達(dá)，其侵襲特性可能與腫瘤細(xì)胞中存在著神經(jīng)膜細(xì)胞分化有關(guān)。

淚腺腺樣囊性癌; S-100;神經(jīng)細(xì)絲酸性蛋白;嗜神經(jīng)性;免疫組織化學(xué)

腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲生長(zhǎng)的特性，常導(dǎo)致疼痛、麻木等周?chē)窠?jīng)受損癥狀或體征,且由于腫瘤細(xì)胞易沿神經(jīng)生長(zhǎng)，使手術(shù)切除范圍非常不易掌握。有學(xué)者推測(cè)，腺樣囊性癌細(xì)胞發(fā)生雪旺細(xì)胞分化可能是其嗜神經(jīng)侵襲的機(jī)制之一[1]。常見(jiàn)的雪旺細(xì)胞標(biāo)志物有S-100蛋白、GFAP等。本研究收集了2005-02至2011-04的28例腺樣囊性癌病例，檢測(cè)S-100、GFAP在腺樣囊性癌有嗜神經(jīng)性侵襲組與無(wú)嗜神經(jīng)性侵襲組中的表達(dá)，旨在探討淚腺腺樣囊性癌嗜神經(jīng)性侵襲性生長(zhǎng)的機(jī)制。以期對(duì)腺樣囊性癌的嗜神經(jīng)侵襲特性采取更有效的針對(duì)性手段。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 28例中，男12例，女16例，年齡25～81歲，平均46歲。根據(jù)臨床癥狀及組織學(xué)觀察有無(wú)嗜神經(jīng)性生長(zhǎng)分為有嗜神經(jīng)侵襲組(15例)和無(wú)嗜神經(jīng)侵襲組(13例)。另取9例正常淚腺組織作為正常對(duì)照。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) (1)結(jié)合臨床上是否有神經(jīng)受損癥狀及HE染色后顯微鏡下觀察有無(wú)瘤細(xì)胞包繞神經(jīng)判定有無(wú)腫瘤嗜神經(jīng)性；若滿足上述兩種條件中的一種,則判斷為有嗜神經(jīng)性[2]。(2)所有患者術(shù)前均未行放、化療。

1.3 試劑 鼠抗人GFAP單克隆抗體及鼠抗人S-100蛋白單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz 公司產(chǎn)品)，SP試劑盒，DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.4 試驗(yàn)儀器 TP1020全自動(dòng)組織脫水機(jī)、EG1140H石蠟包埋機(jī)、EG1140C冷凍臺(tái)、RM2145組織切片機(jī)、HI1210撈片機(jī)、HI1220烤片機(jī)及DMLED顯微鏡等(德國(guó)LEICA產(chǎn)品)；國(guó)產(chǎn)DHP-781電熱恒溫培養(yǎng)箱，WD9001微波爐(格蘭仕)。

1.5 方法 所有標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、浸蠟、石蠟包埋、行2 μm連續(xù)切片。切片經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色后經(jīng)高年資病理醫(yī)師進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，參照2001年世界衛(wèi)生組織(WHO)對(duì)淚腺上皮性腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理診斷[1]。免疫組織染色方法采用SP法。免疫組織化學(xué)染色過(guò)程中，每批染色均設(shè)陰性及陽(yáng)性對(duì)照片，以除外假陽(yáng)性及假陰性結(jié)果。陰性對(duì)照片以PBS緩沖液代替相應(yīng)一抗制成，陽(yáng)性對(duì)照片用已知的S-100及GFAP陽(yáng)性片。

1.6 GFAP染色陽(yáng)性結(jié)果的判斷 GFAP定位于細(xì)胞質(zhì)上，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性。根據(jù)細(xì)胞數(shù)目，將表達(dá)情況分為4級(jí)：(-)細(xì)胞染色數(shù)=0；(+)為0<細(xì)胞染色數(shù)≤33%；(++)為33%<細(xì)胞染色數(shù)≤66%；(+++)為細(xì)胞染色數(shù)>66%。

1.7 S-100染色陽(yáng)性結(jié)果的判斷 S-100定位于胞漿和胞核上，以胞質(zhì)或核中出現(xiàn)棕色顆?；蚓蛔厣珵殛?yáng)性，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞記為(-)，有陽(yáng)性細(xì)胞記為(+)。

2 結(jié) 果

2.1 腺樣囊性癌的嗜神經(jīng)性生長(zhǎng) 28例中，有13例經(jīng)HE染色后進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察和臨床病歷回顧都未出現(xiàn)神經(jīng)受侵表現(xiàn)，有11例在HE染色后進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察出現(xiàn)瘤細(xì)胞包繞神經(jīng)現(xiàn)象(圖1)。通過(guò)病歷回顧，有12例出現(xiàn)疼痛、麻木等明顯神經(jīng)的受損癥狀。神經(jīng)受侵率為53.57%。

圖1 ACC細(xì)胞包繞神經(jīng)生長(zhǎng)現(xiàn)象 (HE，×100)

2.2 S-100在腺樣囊性癌中的表達(dá) S-100定位于胞質(zhì)和胞核上，以胞質(zhì)或核中出現(xiàn)棕色顆?；蚓蛔厣珵殛?yáng)性。無(wú)嗜神經(jīng)侵襲性生長(zhǎng)組中有5例有S-100 的陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度不均，灶性分布，染色較淡。S-100LI為0.62±1.19 。有嗜神經(jīng)侵襲性生長(zhǎng)組中12例有S-100 的陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度不均，染色較強(qiáng)。S-100LI為16.73±24.74(圖2)。有嗜神經(jīng)侵襲性生長(zhǎng)組中的S-100陽(yáng)性表達(dá)率(80%)較無(wú)嗜神經(jīng)侵襲性生長(zhǎng)組(41.67%)呈升高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 S-100在淚腺腺樣囊性癌中的表達(dá) (SP，×100)

2.3 GFAP在腺樣囊性癌中的表達(dá) GFAP定位于細(xì)胞質(zhì)上，以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性。無(wú)嗜神經(jīng)侵襲性生長(zhǎng)組13例中均未見(jiàn)到GFAP的陽(yáng)性表達(dá)。有嗜神經(jīng)侵襲性生長(zhǎng)組15例中9例(60.00%)出現(xiàn)GFAP 的陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度不均，染色較強(qiáng)。兩組GFAP陽(yáng)性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GFAP LI為2.07±3.01。有嗜神經(jīng)侵襲性生長(zhǎng)組中的GFAP陽(yáng)性表達(dá)率較無(wú)嗜神經(jīng)侵襲性生長(zhǎng)組呈升高趨勢(shì)(圖3)。

圖3 GFAP在淚腺腺樣囊性癌中的表達(dá)(SP，×100)

2.4 S-100和GFAP在腺樣囊性癌中的表達(dá)相關(guān)性 28例標(biāo)本中，兩者同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)的6例，同時(shí)出現(xiàn)陰性表達(dá)的8例，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

腺樣囊腺癌居淚腺惡性腫瘤的第1位,具有高度惡性[3-5]。嗜神經(jīng)性侵襲的特性使得淚腺腺樣囊性癌的治療更加棘手，由于腫瘤細(xì)胞易沿神經(jīng)生長(zhǎng)，使得手術(shù)切除范圍非常不易掌握，因此是目前腺樣囊性癌研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。Toth等[6]用神經(jīng)膜細(xì)胞免疫組化標(biāo)記物S-100、GFAP、NSE及神經(jīng)膜細(xì)胞組織化學(xué)標(biāo)記物搔洛鉻(solochrome)對(duì)腺樣囊性癌和多形性低度惡性腺癌作了研究，提出腺樣囊性癌和多形性低度惡性腺癌中突變的肌上皮細(xì)胞存在著神經(jīng)膜細(xì)胞分化。Iwamoto等[7]用神經(jīng)膜細(xì)胞標(biāo)記物p75及GFAP證明了具有神經(jīng)侵襲性的梭形細(xì)胞型惡性黑色素瘤細(xì)胞中存在著雪旺細(xì)胞分化，而在不具嗜神經(jīng)侵襲性的其他亞型中則不存在這種分化，并將其作為惡性黑色素瘤嗜神經(jīng)侵襲的組織學(xué)基礎(chǔ)。羅小龍等[8]通過(guò)免疫組化的方法證明了神經(jīng)膜細(xì)胞標(biāo)志物S-100、GFAP在腺樣囊性癌中有表達(dá)，而在不具有嗜神經(jīng)侵襲性的黏液表皮樣癌中則沒(méi)有表達(dá)，進(jìn)一步證明了腺樣囊性癌的嗜神經(jīng)侵襲與腺樣囊性癌發(fā)生神經(jīng)膜細(xì)胞分化有關(guān)。

S-100蛋白家族是1965年由Moore發(fā)現(xiàn)并命名的一組酸性鈣調(diào)節(jié)蛋白，屬肌鈣蛋白C家族，分子量為20 ku。目前發(fā)現(xiàn)有21個(gè)家族成員。S-100蛋白廣泛分布于不同組織，通過(guò)對(duì)鈣離子的調(diào)節(jié)及與靶蛋白的相互作用，在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)功能，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

以往對(duì)腫瘤有無(wú)嗜神經(jīng)性的判斷單獨(dú)依靠組織形態(tài)學(xué)觀察[6]。本研究在判定腫瘤是否侵襲神經(jīng)時(shí)結(jié)合了臨床癥狀和組織形態(tài)學(xué)觀察兩種方式。結(jié)合臨床上是否有神經(jīng)受損癥狀及HE染色后鏡下觀察有無(wú)瘤細(xì)胞包繞神經(jīng)判定腫瘤嗜神經(jīng)性的有無(wú)，若滿足上述兩種條件中的一種，則判斷為有嗜神經(jīng)性。本研究發(fā)現(xiàn)，組織形態(tài)學(xué)能否觀察到神經(jīng)受侵現(xiàn)象與臨床上是否表現(xiàn)出神經(jīng)受損癥狀并不一致，這說(shuō)明由于病理標(biāo)本取材的局限性，即使腺樣囊性癌細(xì)胞已經(jīng)侵襲神經(jīng)，也未必能通過(guò)組織形態(tài)學(xué)觀察到。而另一方面，由于神經(jīng)處于受侵襲早期，或由于鄰近神經(jīng)的代償作用，即使顯微鏡下能觀察到神經(jīng)受侵現(xiàn)象，臨床上也不表現(xiàn)任何神經(jīng)受損癥狀。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有13例腺樣囊性癌經(jīng)HE染色后進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察和臨床病歷回顧都未出現(xiàn)神經(jīng)受侵表現(xiàn)，有11例在HE染色后進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察出現(xiàn)瘤細(xì)胞包繞神經(jīng)現(xiàn)象，有12例出現(xiàn)疼痛、麻木等明顯神經(jīng)的受損癥狀。

部分非神經(jīng)源性惡性腫瘤除具備浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移一般特性外，還有一個(gè)較為特殊的臨床表現(xiàn)就是顯微鏡下可見(jiàn)癌細(xì)胞多聚集在神經(jīng)束衣和神經(jīng)內(nèi)衣的間隙下，也可散在于神經(jīng)軸柱之間或包裹神經(jīng)纖維。臨床上可以出現(xiàn)感覺(jué)和(或)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能障礙，還可以有腦病表現(xiàn)。神經(jīng)侵襲主要發(fā)生在神經(jīng)周?chē)馨凸艿那忠u[9-13]，嗜神經(jīng)侵襲是ACC的重要生物學(xué)特性之一，也成為淚腺ACC局部復(fù)發(fā)與蔓延不可忽視的重要因素。文獻(xiàn)[12]報(bào)道，頭頸部ACC神經(jīng)侵襲的發(fā)生率為69%，知名神經(jīng)侵犯為28%。

本研究結(jié)果中GFAP在15例有嗜神經(jīng)性腺樣囊性癌的標(biāo)本中有9例為陽(yáng)性表達(dá)，而在13例無(wú)嗜神經(jīng)性腺樣囊性癌標(biāo)本中無(wú)一例陽(yáng)性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。S-100在15例有嗜神經(jīng)性腺樣囊性癌的標(biāo)本中有12例為陽(yáng)性表達(dá)，在13例無(wú)嗜神經(jīng)性腺樣囊性癌標(biāo)本中5例陽(yáng)性表達(dá)。因此，認(rèn)為GFAP、S-100這兩種雪旺細(xì)胞標(biāo)志物在具嗜神經(jīng)性的腺樣囊性癌中有特異性表達(dá)，而在不具嗜神經(jīng)性的腺樣囊性癌中卻沒(méi)有表達(dá)或表達(dá)率低，這與Iwamoto等[7]在惡性黑色素瘤嗜神經(jīng)侵襲的研究結(jié)果類(lèi)似，也與羅小龍等[8]在涎腺腺樣囊性癌的研究結(jié)果類(lèi)似，因此推論淚腺腺樣囊性癌中嗜神經(jīng)性侵襲特性與腫瘤細(xì)胞中存在著神經(jīng)膜細(xì)胞分化有關(guān)。

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(2014-01-12收稿 2014-09-18修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

Expression and significance of S-100 and GFAP in lacrimal adenoid cystic carcinoma

WANG Leifeng1, DONG Yuping1, ZHU Sufang1, LI Xiaojuan1, DONG Qiuyan1,and HEI Yan2.

1.Department of Ophthalmology, Beijing Municipal Corps Second Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100037, China; 2.The Institute of Orbital Disease ,The General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039,China

Objective To investigate the expression of Schwann's cell markers S-100 and GFAP in lacrimal adenoid cystic carcinoma, and to explore the relationship between GFAP or S-100 expression and neural invasion of adenoid cystic carcinoma. Methods Twenty-eight lacrimal adenoid cystic carcinoma and 9 normal lacrimal gland specimens were collected . Each specimen was stained by S-P(streptavidin/peroxidase) immuno- histochemical staining. The expression of S-100 and GFAP was analyzed by immunohistochemistry in order to find the difference in the above-mentioned tissues. One-way ANOVA, Student,s test, chi-square test or linear correlation were carried out for statistical evaluation. Results The average S-100 Index(S-100LI) in nor-neural invasion group and neural invasion group were 0.62±1.19 and 16.73±24.74,respectively,in lacrimal gland adenoid cystic carcinoma. (P<0.05). The average GFAP LI in nor-neural invasion group and neural invasion group were 0 and 2.07±3.01,respectively,in lacrimal gland adenoid cystic carcinoma. (P<0.05). Conclusions Schwann’s cell markers GFAP and S-100 in neural invasion group is higher than that in nor-neural invasion group (P<0.05). The Schwann’s cell differentiation may account histologically for the neural invasion of lacrimal gland adenoid cystic carcinoma.

lacrimal adenoid cystic carcinoma；S-100; glial fibrillary acidic protein; neural invasion; immunohistochemistry

王磊峰，碩士，副主任醫(yī)師，E-mail:wangleifeng123@sina.com

1.100037，武警北京總隊(duì)第二醫(yī)院眼科；2.100039北京，武警總醫(yī)院眼眶病研究所

黑 硯，E-mail:heiy an842@163.com

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