劉 靜，張紅英，段富強(qiáng)，彭 朋，秦永生，薄 海

高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)急進(jìn)高原淋巴細(xì)胞線粒體自噬的影響

劉 靜1，張紅英2，段富強(qiáng)3，彭 朋4，秦永生4，薄 海4

目的 觀察平原短期高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(high-intensity interval training, HIT)對(duì)青年男性急進(jìn)高原淋巴細(xì)胞線粒體自噬的影響。方法 30名世居平原青年男性隨機(jī)分為無(wú)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(NT組，n=15)和HIT組(n=15)。HIT組受試者進(jìn)行HIT訓(xùn)練，以90%～95%心率貯備強(qiáng)度快跑3 min，間歇以45%～50%心率貯備強(qiáng)度慢跑3 min，重復(fù)6個(gè)循環(huán)，1次/d，共2周。NT組除日?；顒?dòng)外不進(jìn)行任何形式運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。訓(xùn)練后所有受試者同批次急進(jìn)高原，在移居高原24 h檢測(cè)淋巴細(xì)胞線粒體復(fù)合體活性，以及PINK1、淋巴細(xì)胞線粒體自噬蛋白Bnip3和Beclin-1蛋白表達(dá)。結(jié)果 與NT組比較，HIT組Bnip3(100±18vs136±32)和Beclin-1(100±19vs119±26)表達(dá)明顯升高(P均<0.05)，線粒體復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和ATP合成酶活性也明顯升高(P<0.05)，PINK1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。結(jié)論 平原階段短期HIT可通過(guò)上調(diào)線粒體自噬閾，從而減少高原低氧環(huán)境下淋巴細(xì)胞線粒體損傷，提高線粒體能量代謝水平。

高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練；高原低氧；淋巴細(xì)胞；線粒體自噬；能量代謝

急性高原反應(yīng)(acute mountain sickness，AMS)是指平原人群急進(jìn)高原時(shí)，機(jī)體各組織、器官處于低壓低氧應(yīng)激狀態(tài)，發(fā)生一系列結(jié)構(gòu)和功能異常變化，如頭痛、心慌、食欲減退、肌力降低等綜合征，嚴(yán)重影響進(jìn)入高原時(shí)的生活質(zhì)量和勞動(dòng)能力。因此，探索預(yù)防和緩解AMS的有效措施具有重要意義。

高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)(high-intensity interval training，HIT)是一種相對(duì)于持續(xù)有氧耐力運(yùn)動(dòng)(continuous endurance training，CET)的訓(xùn)練方式。相同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的HIT與CET比較，HIT運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度較大(接近最大運(yùn)動(dòng)能力)，運(yùn)動(dòng)時(shí)間相對(duì)較短，但其對(duì)心血管適應(yīng)和骨骼肌代謝的健康促進(jìn)效應(yīng)不低于CET，且在提高機(jī)體有氧工作能力方面比CET更具時(shí)效性[1]。無(wú)論對(duì)于健康人群還是肥胖、代謝疾病、心血管疾病人群，HIT的安全性和有效性均得到初步證實(shí)[2]。

線粒體自噬是維持細(xì)胞線粒體質(zhì)量控制體系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，世居平原青年男性移居高原，伴隨高原習(xí)服進(jìn)程，線粒體自噬進(jìn)行性增加，線粒體DNA氧化損傷減少[3,4]，提示提高線粒體自噬是增加細(xì)胞低氧抵抗力的途徑之一。筆者還發(fā)現(xiàn)，常氧環(huán)境，CET 6周可上調(diào)骨骼肌線粒體氧化磷酸化效率及抗氧化酶活性，從而提高大鼠對(duì)急性低氧暴露的耐受能力[5]。常氧環(huán)境短期HIT能否提高機(jī)體低氧耐受能力尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，筆者擬探討平原2周HIT是否可改善人體急進(jìn)高原淋巴細(xì)胞線粒體能量代謝障礙及對(duì)線粒體自噬的影響，為預(yù)防急性高原病提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 采用整群抽樣法，選取同年招收的且無(wú)進(jìn)駐高原經(jīng)歷的青年男性新兵30人為受試者，并隨機(jī)分為未訓(xùn)練組(NT，n=15)和HIT組(HIT，n=15)。HIT組與NT組比較，年齡[(18.3±1.2)歲vs(18.4±0.9)歲]、身高[(173.9±6.1)cmvs(172.7±5.6)cm]、體重[(62.2±7.9)kgvs(61.7±6.5)kg]均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 訓(xùn)練方法 HIT組受試者利用心率貯備(heart rate reserve, HRR)百分比(%HRR)計(jì)算運(yùn)動(dòng)靶心率確定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。運(yùn)動(dòng)靶心率=%HRR+安靜心率，%HRR=(最大心率-安靜心率)×EI，其中最大心率=220-年齡，EI為運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度百分比。參照Weng等[6]方案，HIT組受試者在訓(xùn)練前后分別進(jìn)行3 min 35%～40% HRR強(qiáng)度的慢跑熱身和整理運(yùn)動(dòng)。HIT方案為：以90%～95% HRR強(qiáng)度快速跑3 min，間歇以45%～50% HRR強(qiáng)度放松慢跑3 min，重復(fù)6個(gè)循環(huán)。1次/d，共2周。訓(xùn)練在400 m標(biāo)準(zhǔn)跑道進(jìn)行，訓(xùn)練過(guò)程中利用遙測(cè)心率表(Polar FT1，芬蘭)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)受試者心率，監(jiān)測(cè)者通過(guò)呼喊提醒受試者調(diào)整奔跑速度，將其運(yùn)動(dòng)心率控制在靶心率范圍內(nèi)。NT組除日?；顒?dòng)外不進(jìn)行任何形式運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。

末次訓(xùn)練24 h后，所有受試者同批次由平原地區(qū)(成都，海拔約500 m)乘飛機(jī)直接到達(dá)高原地區(qū)(拉薩，海拔約3700 m)，抵達(dá)高原24 h抽取空腹靜脈血5 ml，EDTA抗凝。訓(xùn)練及測(cè)試期間保證正常飲食和生活規(guī)律，不飲酒、吸煙、服藥。

1.2.2 淋巴細(xì)胞分離 PBS等體積稀釋抗凝血，繼而加入等體積淋巴細(xì)胞分離液，2200 r/min離心20 min，取淋巴細(xì)胞層，PBS洗滌2次，2600 r/min離心，20 min，棄上清，收集淋巴細(xì)胞，-20℃凍存。

1.2.3 淋巴細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性測(cè)定 參照Shinde等[7]的方法，紫外分光光度法檢測(cè)淋巴細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ活性，操作嚴(yán)格按照試劑盒(Novagen)說(shuō)明書進(jìn)行。復(fù)合體Ⅰ活性：在600 nm下檢測(cè)線粒體樣品氧化還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)引起的吸光度變化。復(fù)合體Ⅱ活性：在600 nm下檢測(cè)線粒體樣品還原二氯酚靛酚(DCPIP)引起的吸光度變化。復(fù)合體Ⅲ活性：在550 nm下檢測(cè)線粒體樣品還原細(xì)胞色素c引起的吸光度變化。復(fù)合體Ⅳ活性：在550 nm下檢測(cè)線粒體樣品氧化還原型細(xì)胞色素c引起的吸光度變化。

1.2.4 線粒體ATP合成酶活性測(cè)定 采用熒光素-熒光素酶發(fā)光法。在反應(yīng)介質(zhì)(0.25 mol/L Succose，0.5 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L蘋果酸，1 mmol/L谷氨酸)中順序加入2.0 mg淋巴細(xì)胞蛋白及20 μmol/L熒光素酶(Sigma)，記錄本底發(fā)光強(qiáng)度，再加入4 μM ADP啟動(dòng)反應(yīng)，記錄發(fā)光強(qiáng)度變化。

1.2.5 淋巴細(xì)胞蛋白表達(dá)量檢測(cè) Western blot法檢測(cè)淋巴細(xì)胞PINK1、Bnip3和Beclin-1蛋白表達(dá)量，以β-tubulin作為內(nèi)參。蛋白樣品經(jīng)15% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。一抗4 ℃孵育過(guò)夜，以1∶1000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，使用ECL試劑盒發(fā)光顯影，X線片壓片曝光，掃描定量各條帶相對(duì)灰度值。以NT組條帶灰度值為100%，其灰度值與NT組條帶灰度值的比值，即為其相對(duì)表達(dá)量(%)。

2 結(jié) 果

2.1 淋巴細(xì)胞線粒體復(fù)合體活性 與NT組比較，HIT組淋巴細(xì)胞線粒體復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ATP合成酶活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

表1 兩組青年男性急進(jìn)高原淋巴細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性比較 [n=15；±s, nmol/(min·mg)]

注：NT表示未訓(xùn)練組，HIT表示高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組；與NT組比較：①P<0.05, ②P<0.01

2.2 淋巴細(xì)胞PINK1、Bnip3和Beclin-1蛋白表達(dá)量 與NT組比較，HIT組淋巴細(xì)胞PINK1蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Bnip3和Beclin-1蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01和P<0.05，圖1)。

圖1 兩組青年男性急進(jìn)高原淋巴細(xì)胞OGG1蛋白表達(dá)和mtDNA中8-oxodG含量的變化

3 討 論

HIT與相同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的CET是兩種常用的有氧訓(xùn)練模式。Freyssin等[8]報(bào)道，8周HIT使慢性心衰患者最大攝氧量提高了27%，而CET無(wú)明顯效果。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)，2周HIT使青年男性骨骼肌線粒體能量代謝和抗氧化水平主要調(diào)控因子PGC-1α mRNA表達(dá)升高7倍，而CET僅使PGC-1α mRNA表達(dá)升高4倍。這表明HIT和CET比較，其在誘導(dǎo)健康效應(yīng)和提高有氧工作能力方面更具時(shí)效性，這也是本研究采用HIT作為急進(jìn)高原前運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)方式的重要原因。

本研究中，HIT組淋巴細(xì)胞線粒體復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和ATP合成酶的活性顯著高于NT組。低氧狀態(tài)下進(jìn)行中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng))是一種提高機(jī)體低氧抵抗力的有效方式。筆者前期發(fā)現(xiàn)，4周低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)可顯著提高骨骼肌線粒體生物合成及呼吸鏈氧化磷酸化效率[10]。此外。筆者還發(fā)現(xiàn)在基本高原習(xí)服階段(移居高原90 d)，青年男性淋巴細(xì)胞線粒體膜電位顯著升高，線粒體DNA氧化損傷程度降低[4]。以上表明，平原階段2周HIT訓(xùn)練有效提高機(jī)體高原低氧環(huán)境下線粒體能量代謝能力，與低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)及高原習(xí)服效果相近，可有效提高機(jī)體低氧抵抗能力。

線粒體是細(xì)胞主要氧利用和能量代謝場(chǎng)所，因而成為低氧損傷的重要靶器官。Siddall等[11]報(bào)道，缺血誘導(dǎo)心肌PINK1表達(dá)明顯升高，伴隨線粒體呼吸速率及膜電位降低。PINK1是線粒體損傷的識(shí)別者，去極化線粒體誘導(dǎo)PINK1表達(dá)并由胞漿轉(zhuǎn)位至受損線粒體，其表達(dá)量是線粒體損傷程度的標(biāo)志。本研究中，HIT組淋巴細(xì)胞PINK1表達(dá)明顯低于NT組，提示平原階段2周HIT訓(xùn)練抑制了高原低氧對(duì)淋巴細(xì)胞線粒體的損傷，這可能是HIT組線粒體復(fù)合體活性升高的機(jī)制之一。

線粒體損傷程度超出其修復(fù)能力時(shí)，線粒體自噬啟動(dòng)以清除功能障礙線粒體，并促進(jìn)線粒體生物合成，產(chǎn)生健康線粒體以維持線粒體數(shù)量和質(zhì)量閾值[12]。Zhang等[13]報(bào)道慢性低氧可通過(guò)上調(diào)Bnip3和Beclin-1表達(dá)促進(jìn)線粒體自噬，從而實(shí)現(xiàn)低氧習(xí)服。Bnip3蛋白是通過(guò)羧基端跨膜區(qū)錨定在線粒體外膜，并減少Bcl-2對(duì)Beclin-1的抑制，從而激活線粒體自噬。本研究中，HIT組淋巴細(xì)胞線粒體自噬水平明顯高于NT組，表現(xiàn)為Bnip3和Beclin-1蛋白表達(dá)明顯升高，這可能是HIT組線粒體損傷降低的機(jī)制之一。He等[14]發(fā)現(xiàn)，8周跑臺(tái)訓(xùn)練可促進(jìn)糖尿病小鼠骨骼肌Bcl-2調(diào)控的線粒體自噬，增加骨骼肌糖代謝并降低血糖。Kim等[15]報(bào)道，8周跑臺(tái)訓(xùn)練明顯提高了衰老小鼠骨骼肌線粒體自噬，提高骨骼肌有氧工作能力，提示運(yùn)動(dòng)是誘導(dǎo)線粒體自噬的有效方式，HIT可通過(guò)上調(diào)線粒體自噬提高機(jī)體高原抵抗能力。

總之，本研究證明，平原階段短期(2周)HIT可通過(guò)上調(diào)線粒體自噬減少機(jī)體高原低氧環(huán)境下淋巴細(xì)胞線粒體損傷，從而提高線粒體能量代謝水平，是一種有效的預(yù)防急性高原反應(yīng)的干預(yù)策略。

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(2014-09-22收稿 2014-11-10修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

Effect of high-intensity interval training on mitochondrial autophagy in leukocyte after rush entry into plateau

LIU Jing1, ZHANG Hongying2, DUAN Fuqiang3, PENG Peng4, QIN Yongsheng4, and BO Hai4.

1. Department of Pathology, Affiliated Hospital of Logistics University, Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300162, China; 2. Department of Quality Management, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China; 3. Department of Health, Xizang Autonomous Regional Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Lasa 850000, China; 4. Department of Military Training Medicines, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300309, China

Objective To explore the effect of short-term high-intensity interval training (HIT) in plain on mitochondrial autophagy in leukocyte after rush entry into plateau. Methods Thirty male lowlanders were randomly divided into two groups: untrained group (NT,n=15) and HIT group (n=15). Participants in the HIT group run at a high training intensity, 90%-95% heart rate reserve (HRR) for 3 min, with active pauses of 3 min of walking at 45%-50% of HRR. Participants in the HIT group underwent six sessions of HIT for 36 min/d, 7 days per week for 2 weeks. After training, participants in both HIT and NT groups traveled into plateau in the same batch. Activities of mitochondrial complex, PINK1, Bnip3 and Beclin-1 protein expression in leukocyte were measured in plateau at 24 h after entry. Results As compared with NT group, in HIT group, mitochondrial autophagy proteins Bnip3 (100±18vs136±32) and Beclin-1(100±19vs119±26) expression were significantly elevated(P<0.05). Furthermore, mitochondrial complex Ⅰ, Ⅱ, Ⅳ and ATP synthase activities were significantly elevated (P<0.05), whereas PINK1 protein expression was significantly decreased (P<0.01). Conclusions Short-term HIT in plain can blunt high altitude hypoxia induced mitochondrial impariment and elevated mitochondrial energy metabolism through upregulation of mitochondrial autophagy.

high-intensity interval training; high altitude hypoxia; leukocyte; mitochondrial autophagy; energy metabolism

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(31200894)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃青年基金(12JCQNJC07900)

劉 靜，博士，講師，E-mail：jingjingliuliu@126.com

1.300162天津, 武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院病理科；2.100039北京, 武警總醫(yī)院質(zhì)量管理科；3.850000拉薩,武警西藏總隊(duì)后勤部衛(wèi)生處；4.300309天津,武警后勤學(xué)院軍事訓(xùn)練醫(yī)學(xué)教研室

薄 海，E-mail：bohaixd@126.com

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