唐 亮，李 健，屈 晨，周月宏，張 曼

WY14643對高血壓大鼠血管內(nèi)皮的保護作用

唐 亮1，李 健1，屈 晨1，周月宏2，張 曼1

目的 觀察WY14643對高血壓大鼠血管內(nèi)皮的作用機制。方法 通過將38-42周的自發(fā)性高血壓大鼠SHR分離獲取主動脈，水浴在10 ml的組織浴槽中。隨機分為2組，SHR組9只使用蒸餾水處理作為對照，WY14643組10只使用WY14643進行干預(yù)，搜集浴槽中的液體，檢測血管舒張因子的變化，檢測血管組織中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的改變。結(jié)果 經(jīng)過WY14643處理后，與SHR組相比，WY14643組 NO( 23.4±3.2) μmol/L和PGI2(前列環(huán)素)(413.5±113.6)ng/L的含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 WY14643對高血壓大鼠血管內(nèi)皮具有保護作用。

高血壓大鼠SHR；血管舒張因子；一氧化氮合成酶；前列環(huán)素;內(nèi)皮素

近年來，隨著社會環(huán)境、人口老齡化及生活習(xí)慣的改變，高血壓病的發(fā)生率越來越高，繼而導(dǎo)致各種心腦血管疾病的發(fā)生呈增高趨勢[1]。研究表明，內(nèi)皮細胞在高血壓病的發(fā)生中具有重要作用，血管內(nèi)皮細胞通過釋放血管內(nèi)皮素，保持其平衡來調(diào)節(jié)血管的收縮節(jié)律。高血壓、糖尿病等病理狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞損傷，使得舒縮因子的平衡被打破，從而導(dǎo)致冠心病等疾病的發(fā)生。Van Bilsen[2]提出衰竭心肌代謝重構(gòu)(metabolic remodeling)的概念后,心肌細胞糖脂利用和能量代謝紊亂被認為參與了冠心病的發(fā)生，過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)在其中的作用越來越多的被揭示，其廣泛的分布于血管內(nèi)皮及心肌細胞中，PPAR表達下降可能是心肌底物和能量代謝紊亂的基礎(chǔ)，有可能是冠心病發(fā)病的機制[3]。Wy14643是過氧化物酶體增殖物激活受體雙重激動藥，它可能對于內(nèi)皮功能具有保護作用。本研究使用SHR觀察Wy14643對血管舒張因子和收縮因子的影響，進一步探討其對高血壓發(fā)生過程中內(nèi)皮功能障礙改善機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 38～42 周的雄性SHR大鼠19只，體重340～380 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，清潔條件下喂食標準飼料，自由飲水，飼養(yǎng)于12 h/12 h明暗交替的環(huán)境中，溫度(21±1)℃。

1.2 試劑 Wy14643(CAS 50892-23-4| 圣克魯斯生物技術(shù)公司)，PGI2 ELISA試劑盒(上?？泼羯锟萍加邢薰?BH4617),EDHFELISA試劑盒(上海藍基生物科技有限公司，批號E02E0131), ET-1ELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，貨號：42101)， AngⅡELISA試劑盒(上海武昊經(jīng)貿(mào)有限公司，貨號：E90005Ra )，NOS羊多克隆抗體(RSm-2118M，Sigma公司)。

1.3 實驗動物分組及主動脈分離 SHR大鼠隨機分為SHR組(9只)和Wy14643組(10只)，通過腹腔注射10%的水合氯醛進行麻醉，0.25 ml/100 g，阻斷血流或離斷血管后10 min內(nèi)將目標血管獲得，立即保存在4℃克-林二氏重碳酸鹽緩沖液(pH 7.4)中，NaCl(118 mM),KCl(4.7 mM),MgSO4(2.5 mM),KH2PO4(1.2 mM),CaCl2(2.5 mM),NaHCO3(25 mM) ,葡萄糖(11.1 mM))，加入苯腎上腺素 (1 mM)，刺激血管收縮， Wy14643組使用0.1 nM的Wy14643進行處理，處理時間為20 min，SHR組大鼠使用蒸餾水處理作為對照。

1.4 NO含量測定 用LS55熒光分光光度儀測定已知濃度的N-乙酰半胱氨酸-亞硝基硫醇標準溶液在334/453 nm的熒光強度,制定標準曲線。測定反應(yīng)體系中加入血管蛋白勻漿前后的熒光強度改變從而計算NO含量。

1.5 ELISA檢測PGI2 嚴格按照各種因子的ELISA試劑盒的說明書進行 操作，具體簡述如下：設(shè)1孔為空白對照孔( 加100 μl 的蒸餾水)， 設(shè)立標準孔8孔，將標準品梯度稀釋(0、50、10、25、50、100 μmol/L)各100 μl按照次序分別加入空白微孔中(設(shè)立復(fù)孔) ，于空白微孔中依次加入各組樣品血漿100 μl;每孔中加入第一抗體工作液50 μl，充分混勻后將反應(yīng)板密封，室溫置于搖床 3 h，用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，每孔加酶標抗體工作液(Anti-Rabbit IgG)100 μl，充分混勻?qū)⒎磻?yīng)板密封，置于室溫1 h，用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，每孔中加入底物工作液100 μl, 置于37 ℃暗處反應(yīng)30 min，每孔中加入50 μl終止液混勻，用酶標儀在450 nm處測吸光值，制作標準曲線，并計算數(shù)值[4]。

1.6 Westernblor檢測eNOS的表達 取-70 ℃ 保存的血管組織 50 mg 采用RIPA裂解液(碧云天生物公司)提取總蛋白，取樣品10 μl采用考馬斯亮藍法測定總蛋白濃度，取40 μg總蛋白上樣，經(jīng)12%的分離膠電泳分離蛋白，半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜上， 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗膜后分別與抗NOX抗體(1∶600，Sigma )和抗β -actin 的抗體(1∶1000 ，Sigma ) 4 ℃ 雜交過夜，然后與辣根過氧化物酶標記的對應(yīng)二抗室溫雜交2 h， ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測反應(yīng)產(chǎn)物信號。 每個標本重復(fù)3次，以β -actin為內(nèi)參進行相對定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 WY14643對高血壓大鼠NO和PGI2的影響 SHR組NO 含量(5.4±1.6) μmol/L, PGI2含量(27.3±5.6) ng/L。 WY14643組經(jīng)過WY14643處理后， NO含量(23.4±3.2)μmol/L、 PGI2含量(413.5±113.6)ng/L。與SHR組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 WY14643對高血壓大鼠eNOS的影響 取-70 ℃保存的血管組織，用Westrnblot檢測兩組血管組織中eNOS的表達，Westrnblot結(jié)果顯示W(wǎng)Y14643組血管中eNOS(內(nèi)皮型一氧化氮合酶)的蛋白表達明顯高于SHR組(P<0.05，圖1)。

圖1 WY14643組大鼠的血管中eNOS明顯升高

3 討 論

自從提出衰竭心肌代謝重構(gòu)的概念后，越來越多的證據(jù)支持心肌細胞糖脂利用和能量代謝紊亂導(dǎo)致心肌重構(gòu)，最終導(dǎo)致充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)的發(fā)生和發(fā)展。近年來，學(xué)者們逐漸認識到代謝性核受體，尤其是PPAR是正常生理代謝和慢性代謝性疾病發(fā)病機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。代謝性核受體是心肌代謝的節(jié)點，在心肌代謝中尤為重要的是PPAR。許多糖脂代謝酶蛋白均是PPAR的靶基因。CHF患者心肌PPAR表達下降可能是心肌底物和能量代謝紊亂的基礎(chǔ)。PPAR廣泛存在于血管內(nèi)皮及心肌細胞中[1]。

CHF患者心肌組織PPAR亞型α的表達較正常供體心臟組織下降54%。由此推斷PPAR α受損可能參與CHF的發(fā)生發(fā)展,目前菲諾貝特已作為PPAR 亞型α激動藥被廣泛臨床應(yīng)用。冠心病、高血壓及慢性心功能不全患者體內(nèi)交感的激活早已成為定論，血和組織兒茶酚胺水平增加將導(dǎo)致脂肪細胞中三酰甘油分解增加，使得血游離脂肪酸水平增加，成為導(dǎo)致心肌胰島素抵抗的主要機制。過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑亞型γ已被廣泛應(yīng)用作為胰島素增敏劑，增加細胞對胰島素的利用。

PPAR亞型α和亞型γ的雙重激動藥WY14643是通過干預(yù)血管內(nèi)皮收縮因子的釋放來調(diào)節(jié)內(nèi)皮的損傷與修復(fù)[5]。在高血壓狀態(tài)下，大鼠的血管內(nèi)皮釋放出的血管收縮因子，使得疾病進一步加重，導(dǎo)致了一個惡性的循環(huán)模式[6]。血脂及血糖的異?？梢砸饎用}粥樣硬化斑塊形成已被臨床證實，但PPAR雙重激動藥Wy14643除調(diào)整血糖及血脂外對高血壓的干預(yù)的相關(guān)機制還不明確。血管內(nèi)皮收縮因子的產(chǎn)生是通過環(huán)氧化酶介導(dǎo)的[7]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過WY14643處理后的SHR大鼠血管，NO和PGI2的含量明顯升高，在生理情況下血管內(nèi)皮細胞可產(chǎn)生血管內(nèi)皮素，如血管收縮因子和舒張因子并保持其平衡，從而可以調(diào)節(jié)血管的收縮與舒張，NO和PGI2經(jīng)過大量研究證明都是血管舒張因子，可以增強血管的舒張功能。尤其是NO可以通過細胞膜迅速傳遞，并可以達到血管平滑肌細胞，使平滑肌松弛，從而動脈血管擴張，以完成調(diào)節(jié)血壓和血流分布的作用。也有研究證實，內(nèi)源性NO不僅有血管舒張功能，還能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮的生長[8]，觸發(fā)血管活性物質(zhì)的釋放，促進血管生長與再生，對血管起到保護作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，大鼠血管eNOS(內(nèi)皮型一氧化氮合酶)的表達也明顯升高，eNOS的升高，促使NO合成的增加，起到血管舒張及血管保護作用[9]，從而進一步印證了WY14643對血管內(nèi)皮的保護作用。WY14643通過對過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)亞型α和亞型γ的作用，促使血管內(nèi)皮產(chǎn)生更多的eNOS，使NO的表達增加，同時也使PGI2的含量明顯升高，它們對血管內(nèi)皮共同起到保護作用[10]。

綜上所述，應(yīng)用PPAR雙重激動藥WY14643能改善血管內(nèi)皮收縮，血管內(nèi)皮收縮是高血壓的獨立風(fēng)險因素，減少血管內(nèi)皮收縮是降低血壓的方式之一，也表明PPAR雙重激動藥WY14643是提高血管內(nèi)皮功能的有效藥物。

[1] Ashrafian H，F(xiàn)renneaux M P, Opie L H,etal. Mechanisms in heart failure[J]. Circulation, 2007, 116(6):434-448.

[2] Vanhoutte P M, Shimokawa H, Tang E H,etal. Endothelial dysfunction and vascular disease[J]. Acta Physiol, 2009, 196(8):193-222.

[3] Wieneke N, Neusch?fer Rube F, Bode L M,etal. Synergistic acceleration of thyroid hormone degradation by phenobarbital and the PPAR alpha agonist WY14643 in rat hepatocytes Kuna M [J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2009, 24(1):99-107.

[4] Yanagisawa J, Shiraishi T, Iwasaki A,etal. PPARalpha ligand WY14643 reduced acute rejection after rat lung transplantation with the upregulation of IL-4, IL-10 and TGFbeta mRNA expression [J]. J Heart Lung Transplant, 2009, 28(11):1172-1179.

[5] Chen K, Li Y H, Xu S Q,etal. Protective Effects of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-α Agonist, Wy14643, on Hypoxia/Reoxygenation Injury in Primary Rat Hepatocytes[J]. PPAR Res, 2012, 13(12): 547-553.

[6] 姚依群. β受體阻滯藥在高血壓治療中的應(yīng)用及地位[J]. 武警醫(yī)學(xué), 2008, 19(3): 197-200.

[7] Bernardes A, Souza P C, Muniz J R,etal. Molecular mechanism of peroxisome proliferator activated receptor α activation by WY14643: a new mode of ligand recognition and receptor stabilization[J]. J Mol Biol, 2013, 425(16):2878-2893.

[8] Reichenbach G, Starzinski-Powitz A, Sloane B F,etal. PPARα agonist Wy14643 suppresses cathepsin B in human endothelial cells via transcriptional, post-transcriptional and post translational mechanisms[J]. Angiogenesis, 2013, 16(1):223-233.

[9] 朱冰坡,曹 劍,李 健,等. 上調(diào)血紅素氧合酶-1對實驗性糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能及血壓的影響[J]. 武警醫(yī)學(xué), 2011, 22(6): 490-494.

[10] Qu C, Leung S W, Vanhoutte P M,etal. Wy14643 improves vascular function in the aorta of the spontaneously hypertensive rat mainly by activating peroxisome proliferator-activated receptors alpha[J]. Eur J Pharmacol, 2012, 696(1):101-110.

(2013-10-26收稿 2013-12-20修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

Effect of WY14643 on vascular endothelial function in hypertensive rats

TANG Liang1, LI Jian1, QU Chen1, ZHOU Yuehong2, and ZHANG Man1.

1.Department of Cardiology,2. Department of Endocrinology, Central Hospital Attached to Shenyang Medical College, Shenyang 110024,China

Objective To observe the effect of WY14643 on vascular endothelium in rats with hypertension. Methods We selected spontaneous hypertensive rats(SHR) of 38-42 weeks, isolated the aorta and bathed it in 10 ml tissue bath. We randomly divided them into 2 groups: rats of SHR group was just treated with distilled water as control group, 10 rats of WY14643 group was only treated with WY14643 as intervention group.The liquid in bath was collected to detect the changes of vasodilator and eNOS in vascular tissue. Results NO and PGI2(prostacyclin) levels and eNOS(nitric oxide synthase) expression were significantly increased after WY14643 treatment.There was a statistically significant difference (P<0.05) between the two groups. Conclusions WY14643 plays a protective role on vascular endothelium in rats with hypertension.

SHR hypertension rats；vasodilatation factors；nitric oxide synthetase; prostacyclin；endothelin

沈陽醫(yī)學(xué)院青年基金支持項目(20122029)

唐 亮，碩士，主治醫(yī)師，E-mail: hannash@eyou.com

120001,沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院:1.循環(huán)科，2.內(nèi)分泌科

R544.1