陳媛 丘增萍 吳楣 藍(lán)紅梅 宋增炫 陳文露

·論著·

高效液相色譜法測(cè)定合劑中苯甲酸的含量

陳媛 丘增萍 吳楣 藍(lán)紅梅 宋增炫 陳文露

目的采用高效液相色譜法(HPLC法)測(cè)定合劑(前胡桑菊合劑、五柑合劑、胃腸合劑、佛耳合劑)中苯甲酸的含量。方法用乙酸乙酯提取合劑中的苯甲酸, 提取液濃縮后采用HPLC法進(jìn)行測(cè)定。選擇Thermo Syncronis C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 以甲醇-磷酸二氫鉀(0.05 mol/L) (45：55)為流動(dòng)相, 流速為1.0 ml/min, 柱溫為30℃, 檢測(cè)波長(zhǎng)為226 nm。結(jié)果苯甲酸回歸方程Y=5835283.5514 X-23440.3860(R=0.9999), 在0.020～0.1018 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；前胡桑菊合劑、五柑合劑、胃腸合劑、佛耳合劑平均回收率分別為99.79%、99.37%、99.34%、99.92%；RSD分別為0.35%、0.10%、0.76%、0.36%(n=3)。結(jié)論測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性良好。

高效液相色譜；合劑； 苯甲酸；含量測(cè)定

由于生產(chǎn)工藝方面的因素以及患者服藥時(shí)可能造成的污染, 大多數(shù)合劑都添加了防腐劑以防藥物變質(zhì)。《中國(guó)藥典》2010年版一部［1］規(guī)定了中藥合劑中苯甲酸含量不得超過(guò)0.3%(其鉀鹽、鈉鹽的用量分別按酸計(jì)), 《中國(guó)醫(yī)院制劑規(guī)范》［2］也相應(yīng)規(guī)定了防腐劑的加入限量。但是《中國(guó)藥典》或其他國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［3-5］至今都尚未對(duì)此類(lèi)藥品中防腐劑苯甲酸的含量測(cè)定方法做出相應(yīng)的規(guī)定, 使該類(lèi)藥品中苯甲酸的含量難于監(jiān)控。而且, 合劑中成分復(fù)雜, 雜質(zhì)多, 為防腐劑的含量測(cè)定帶來(lái)一定的困難。防腐劑雖然可以抑制藥品中微生物的繁殖, 但添加過(guò)量, 患者在服用或使用后, 不僅會(huì)破壞人體內(nèi)的維生素B1, 還會(huì)與鈣生成不溶物, 影響人體對(duì)鈣的吸收；并且還對(duì)呼吸道黏膜［6］和胃腸道有刺激作用, 慢性病需長(zhǎng)期使用者服用過(guò)量還可能誘發(fā)癌癥。在防腐劑種類(lèi)中, 苯甲酸因其抑菌范圍廣、價(jià)格低廉, 在藥品防腐中被廣泛應(yīng)用, 但同時(shí)苯甲酸也較其它防腐劑如山梨酸等毒性大［7］, 還對(duì)人體的毒性有疊加作用, 因此本文研究了苯甲酸的含量測(cè)定。作者參考了有關(guān)食品中苯甲酸的測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)［8］及相關(guān)文獻(xiàn)［9,10］, 設(shè)計(jì)了用乙酸乙酯提取合劑中的苯甲酸, 提取液濃縮后采用高效液相色譜法(HPLC法)進(jìn)行測(cè)定的方法, 為合劑中苯甲酸限量控制提供了依據(jù), 為用藥安全提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 日本島津(LC-20A型)高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣, 紫外檢測(cè)器), ECOSIL HPLC COLUMN-C18色譜柱, pH計(jì), AG135電子天平(瑞士), 超聲波清洗儀(SK25OH型)苯甲酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所, 批號(hào)：100419-200301, 含量：99.9%)；甲醇：色譜純(天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；乙酸乙酯：分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。樣品：前胡桑菊合劑(131113, 130906, 131004)、五柑合劑(130805, 130304, 130409)、胃腸合劑(130725, 130608, 130716)、佛耳合劑(130613, 130905, 130407)均由梅州市中醫(yī)院提供。

1.2方法

1.2.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性條件 采用THermo Syncronis C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 以甲醇-磷酸二氫鉀(0.05 mol/L) (45：55)為流動(dòng)相, 流速為1.0 ml/min, 柱溫為30℃, 檢測(cè)波長(zhǎng)為226 nm, 進(jìn)樣量為10 μl, 理論板數(shù)以苯甲酸計(jì)＞4000, 分離度＞1.5, 拖尾因子符合要求。

1.2.2供試品溶液的制備 精密量取合劑10 ml, 用乙酸乙酯振搖提取3次, 30 ml/次, 合并提取液, 蒸干, 殘?jiān)眉状既芙? 轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中, 用甲醇定容, 搖勻；再精密量取5 ml上述溶液至50 ml量瓶, 用流動(dòng)相稀釋至刻度, 搖勻, 用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò), 即得。

1.2.3對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取苯甲酸對(duì)照品12.74 mg, 置于25 ml量瓶中, 加適量甲醇超聲溶解, 溶液冷卻后定容, 作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.5090 mg/ml)；精密量取5 ml對(duì)照品儲(chǔ)備液于50 ml量瓶中, 用流動(dòng)相稀釋至刻度, 作為對(duì)照品溶液(50.90 μg/ml)。

1.2.4陰性空白對(duì)照溶液的制備 按合劑處方比例和制備工藝, 自制不含苯甲酸的合劑作為陰性溶液。精密量取該陰性溶液10 ml, 按1.2.3制備方法制成陰性空白對(duì)照溶液。

2 結(jié)果

2.1專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液, 按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣, 測(cè)定峰面積, 記錄色譜圖, 見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)陰性對(duì)照在對(duì)照品相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰, 說(shuō)明方法專(zhuān)屬性強(qiáng)。

圖1 高效液相色譜圖

2.2線性關(guān)系 精密量取苯甲酸對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.5090 mg/ml) 1、2、3、4、5 ml置25 ml量瓶中, 用流動(dòng)相稀釋到刻度, 搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò), 按上述色譜條件, 進(jìn)樣10 μl, 以峰面積為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量μg為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 回歸方程為Y=5835283.5514X-23440.3860(r=0.9999), 在0.020 ～0.1018 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次, 10 μl/次,測(cè)得苯甲酸峰面積。結(jié)果顯示, 對(duì)照品苯甲酸平均峰面積為3540959, RSD為0.10%(n=6)。結(jié)果表明, 精密度良好, 所選的色譜條件穩(wěn)定。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液于室溫下放置, 經(jīng)0、6、12、18、24 h后按上述色譜條件進(jìn)樣1次, 測(cè)定峰面積。結(jié)果供試品溶液的平均峰面積為3544780, RSD為0.19%, 表明24 h內(nèi)苯甲酸溶液基本穩(wěn)定。

2.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的前胡桑菊合劑、五柑合劑、胃腸合劑、佛耳合劑各3份, 按“1.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備, 在相同色譜條件下測(cè)定。結(jié)果樣品中含苯甲酸平均濃度分別為0.15%、0.14%、0.04%、0.08%；RSD分別為0.19%、0.15%、0.11%、0.12%(n=3)。表明用本法測(cè)定含量,重復(fù)性較好。

2.6加樣回收試驗(yàn) 精密量取已知含量的上述4種樣品1 ml各3份, 分別置于100 ml容量瓶中, 每種樣品分別加入苯甲酸儲(chǔ)備液1.0 、1.5 、2.0 ml, 用流動(dòng)相稀釋到刻度, 搖勻, 用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò), 按上述色譜條件, 進(jìn)樣10 μl, 結(jié)果平均回收率分別為100.69%、98.66%、96.83%、98.60%；RSD分別為1.03%、0.45%、0.69%、0.49%(n=3), 表明此方法測(cè)定含量準(zhǔn)確度高。

2.7樣品含量測(cè)定 按“1.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測(cè)定峰面積, 根據(jù)樣品中的苯甲酸的含量情況, 選定峰面積相近濃度的對(duì)照品溶液。對(duì)照品溶液和供試品溶液中的苯甲酸的相應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi),測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 苯甲酸的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)苯甲酸對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描, 測(cè)得苯甲酸的最大吸收波長(zhǎng)在226 nm處, 因此選擇226 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2流動(dòng)相的選擇 對(duì)流動(dòng)相組成進(jìn)行了考察, 分別選用了甲醇—水、乙腈—水等體系進(jìn)行試驗(yàn), 峰的保留時(shí)間和分離效果不理想。后參考文獻(xiàn)改用甲醇—磷酸二氫鉀溶液(pH=3.8)為流動(dòng)相。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)所得, 當(dāng)比例為甲醇:磷酸二氫鉀(0.05 mol/L)(45:55)時(shí), 色譜分離的峰純度最高, 與其他組分的色譜峰分離良好。

3.3供試品提取方法的選擇 因?yàn)楹蟿┲须s質(zhì)較多, 無(wú)法直接用微孔濾膜濾過(guò), 所以需要萃取以減少雜質(zhì)。查閱文獻(xiàn),用乙酸乙酯和乙醚均可提取合劑中的苯甲酸, 但經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證乙酸乙酯效果更好, 故采用乙酸乙酯萃取的方法提取合劑中的苯甲酸。

3.4色譜柱的選擇 試驗(yàn)比較了Agilent ZORBAX SB-Aq (4.6 mm×250 mm, 5 μm)、Waters Symmetry Shield TM RP18 (4.6 mm×150 mm, 5 μm)和Thermo syncronis-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)三種型號(hào)的色譜柱的分離效果。結(jié)果顯示, 三種色譜柱均能達(dá)到分離效果, 所以該三種色譜柱均適用于本實(shí)驗(yàn),但在比較出峰時(shí)間的情況下, Agilent公司生產(chǎn)的ZORBAX SB-Aq柱出峰時(shí)間更適合, 也更穩(wěn)定, 所以本實(shí)驗(yàn)選擇Agilent ZORBAX SB-Aq柱進(jìn)行試驗(yàn)。

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［2］ 潘學(xué)田.中國(guó)醫(yī)院制劑規(guī)范·西藥制劑.第2版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 1995:4.

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Determination of benzoic acid in mixture by HPLC

CHEN Yuan, QIU Zeng-ping, WU Mei, et al.Mei zhou Institute for Food and Drug Control, Meizhou 514071, China

Objective To establish a high performance liquid chromatography(HPLC) method for the determination of(Qianhu Sangju mixture, Wugan mixture, Weichang mixture, Foer mixture) benzoic acid.MethodsThe extraction mixture of benzoic acid with ethyl acetate, the concentrated extract was determined by HPLC method.Select the thermo syncronis C-18(250 mm×4.6 mm, 5 μm), with methanol and potassium dihydrogen phosphate(0.05 mol/L) (45:55) as mobile phase, flow rate of 1.0 ml/min, column temperature was 30℃ , the detection wavelength was 226 nm.ResultsBenzoic acid regression equation was Y=5835283.5514 X-23440.3860(R=0.9999), in 0.020～0.1018 mg/ml the linear relationship was good; Qinhu Sangju mixture, Wugan mixture, Weichang mixture, Foer mixture the average recovery rate was 99.79%, 99.37%, 99.34%, 99.92%; RSD=0.35%, 0.10%, 0.76%, 0.36%(n=3).ConclusionThis method is simple and accurate, with a strong specificity, so it can be used as preparation for the quality control.

High performance liquid chromatography; Mixture; Benzoic acid; Content determination

2014-03-28］

514071 梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所(陳媛 丘增萍吳楣 藍(lán)紅梅 宋增炫)；嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院(陳文露)