劉海青 劉富平 胡文婷
摘要:采用富集平板稀釋法、剛果紅染色法選育壯實鹿角珊瑚纖維素分解菌,用DNS法測定菌株降解纖維素酶活。結(jié)果表明,壯實鹿角珊瑚體內(nèi)含有共附生纖維素分解菌,該菌可分泌降解纖維素酶,富集培養(yǎng)及剛果紅染色法可有效篩選此類活性菌株。
關(guān)鍵詞:壯實鹿角珊瑚;纖維素;生物質(zhì)
中圖分類號: Q939.9文獻標志碼: A文章編號:1002-1302(2014)02-0329-02
收稿日期:2013-05-29
基金項目:長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(編號:IRT1123);海南省教育廳高等學??茖W研究項目(編號:Hjkj2008-15);海南大學青年基金(編號:qnjj1151)。
作者簡介:劉海青(1971—),女,山西大同人,碩士,副教授,主要從事天然產(chǎn)物活性研究。Tel:(0898)66289567;E-mail:892035892@qq.com。
通信作者:劉富平,博士,副教授,主要從事微生物制藥研究。生物質(zhì)是唯一可以轉(zhuǎn)化為液體燃料的可再生能源[1],以木屑、農(nóng)作物秸稈、椰殼等生物質(zhì)為原料的纖維素乙醇,不僅避免了生物乙醇與人爭糧爭地的弊端,而且燃放時釋放的溫室氣體與燃燒汽油相比少90%[2]。微生物是纖維素酶的主要來源[3],分離、選育出針對不同行業(yè)的高效降解纖維素菌種,促使纖維素資源化利用已成為國內(nèi)外的研究熱點[4]。海洋微生物資源豐富,許多微生物寄生在珊瑚體內(nèi)或附著在珊瑚表面,與珊瑚協(xié)同進化,在演化過程中二者形成了互惠關(guān)系[5]。海洋高鹽、高壓、低溫、寡營養(yǎng)等獨特的環(huán)境賦予了海洋微生物獨特的代謝途徑[6]。珊瑚共附生菌不僅能夠獨立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物,還可分泌具有各種功能的活性酶,參與珊瑚次生成分的合成,或?qū)ι汉鞔紊x產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化[7],是天然產(chǎn)物新的來源。本研究選育壯實鹿角珊瑚纖維素分解菌,旨在為促進纖維素資源化利用提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
壯實鹿角珊瑚樣品采自海南島蜈支洲近海海域。富集培養(yǎng)基(CMC):KH2PO4 0.2% 、MgSO4 0.015%、KNO3 0.1%、CMC-Na 1%,共100 mL。馬鈴薯培養(yǎng)基:馬鈴薯100 g、葡萄糖10 g、NaCl 5 g、瓊脂7.5~100 g、無菌水500 mL、pH值自然,共500 mL。真菌初篩培養(yǎng)基:K2HPO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NaCl 6 g、CMC-Na 15 g、瓊脂粉 1.5%、(NH4)2SO4 2.0 g、CaCl2 0.1 g、KH2PO4 0.5 g、pH值70~74、蒸餾水1 000 mL。真菌保種培養(yǎng)基:真菌培養(yǎng)基(PDA)。甲液:將6.9 g結(jié)晶苯酚溶于15.2 mL 10% NaOH溶液,用蒸餾水稀釋至69 mL,在此溶液中加入6.9 g亞硫酸氫鈉。乙液:將255 g酒石酸鉀鈉溶于300 mL 10% NaOH溶液中,再加入880 mL 1% 3,5-二硝基水楊酸溶液。將甲乙溶液混合即得黃色試劑,儲于棕色瓶中放置7~10 d后使用。溶液在棕色瓶內(nèi)保存1年有效。
1.2方法
1.2.1壯實鹿角珊瑚樣品懸液的制備將30 g壯實鹿角珊瑚樣品加少量水磨碎后轉(zhuǎn)移至盛有10 mL CMC富集培養(yǎng)液中,靜置。
1.2.2纖維素降解菌的富集培養(yǎng)取以上壯實鹿角珊瑚樣品懸液10 mL轉(zhuǎn)入無菌三角瓶中,30 ℃下振蕩培養(yǎng)1~3 d,按2%的接種量,取0.2 mL菌液轉(zhuǎn)接至10 mL新富集培養(yǎng)基CMC2中進行第2次富集培養(yǎng)。
1.2.3纖維素降解菌的篩選分別取富集培養(yǎng)后的2種菌懸液各1 mL做系列稀釋,稀釋105~107倍,每種菌液取 0.1 mL 分別涂布于真菌培養(yǎng)基PDA及細菌選擇平板,每種稀釋倍數(shù)做3個平行板,平板于30 ℃下恒溫培養(yǎng)1~3 d,以平板上出現(xiàn)均勻的單菌落為準。待長出單菌落后(以40個單菌落為準)選取4個平板。用接種環(huán)挑選單菌落點種在真菌及細菌初篩培養(yǎng)基上,每板接種5株菌株。每株菌株點種2個平板,1個平板用于剛果紅染色,另一個作為保存平板。
1.2.4纖維素降解菌的初步鑒定剛果紅染色法:30 ℃培養(yǎng)1~3 d后,測量并記錄各菌落直徑后用70%乙醇將菌落洗下,然后用0.1%剛果紅浸染30 min,傾去染液,再用1 mol/L NaCl浸泡脫色30 min,傾去NaCl浸泡液,觀察菌落周圍有無透明圈,若有透明圈,測量并記錄透明圈的直徑,計算透明圈直徑與菌落直徑的比值(HC值)。
1.2.5纖維素降解菌的分離純化挑選HC值大于1的菌株作為初篩菌種,通過連續(xù)劃線法分離純化菌株,將鏡檢后得到的初篩菌株轉(zhuǎn)接到保種培養(yǎng)基保藏斜面,4 ℃下保藏備用。
2結(jié)果與分析
2.1纖維素降解菌的篩選
采用以CMC-Na為唯一碳源富集平板稀釋分離,圖1、圖2為壯實鹿角珊瑚真菌第3天至第8天的生長變化過程,第3天培養(yǎng)基上長出1個圓斑,營養(yǎng)菌絲呈圓形晶亮白色放射狀,中間有1個黑色孢子囊,孢子囊逐漸向周圍擴散,覆蓋了白色菌絲。
2.2纖維素降解菌的初步鑒定
經(jīng)剛果紅染色法初步鑒定,分離到1株具有降解纖維素能力的真菌,試驗表明,纖維素降解菌染色后能在纖維素瓊脂培養(yǎng)基上快速產(chǎn)生清亮的透明圈,HC值>1(圖3、圖4)。
3結(jié)論與討論
本研究表明,壯實鹿角珊瑚體內(nèi)含有共附生纖維素分解菌,該菌可分泌降解纖維素酶,富集培養(yǎng)及剛果紅染色法可有效篩選此類活性菌株。筆者最初采用羧甲基纖維素鈉CMC-Na-剛果紅培養(yǎng)基進行纖維素降解菌初篩,但是菌株無法在培養(yǎng)基上生長且不能產(chǎn)生透明圈,所以改用富集后的培養(yǎng)液進行梯度稀釋,涂布于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)接到真菌初篩培養(yǎng)基上,再用剛果紅染色法染色,1~2 d后可以看到清晰的透明圈,說明此菌株只能以先培養(yǎng)后剛果紅染色的方法進行初步鑒定。
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