謝園園+楊金雨露+吳玲+曹麗平+賴齊賢

摘要：介紹了觀賞植物游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展，并對(duì)游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了分析，探討了影響單倍體植株獲得的因素，闡述了存在的問(wèn)題，并對(duì)游離小孢子育種技術(shù)進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：觀賞植物；游離小孢子培養(yǎng)；單倍體；育種

中圖分類號(hào)：S680.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）02-0134-04

收稿日期：2013-07-05

作者簡(jiǎn)介：謝園園（1990—），女，安徽六安人，碩士研究生，主要從事園林植物遺傳育種研究。E-mail： xieyuanyuanyx@163.com。

通信作者：賴齊賢，博士，教授，從事花卉育種、園藝植物栽培研究。E-mail：laiqixian@zafu.edu.cn。我國(guó)觀賞植物種類繁多，它們有著各自不同的形態(tài)、生態(tài)習(xí)性、繁殖方式，很多觀賞植物還兼具藥用、食用價(jià)值。近年來(lái)，世界各國(guó)花卉產(chǎn)業(yè)發(fā)展速度較快，進(jìn)行花卉育種以獲得優(yōu)質(zhì)花卉品種顯得尤為重要。各國(guó)開始重視保護(hù)、收集珍稀瀕?；蛘咝誀顑?yōu)良的植物品種，很多學(xué)者曾考慮利用單倍體育種來(lái)快速保存種質(zhì)資源，但單倍體植物生長(zhǎng)勢(shì)弱、無(wú)法結(jié)種、利用價(jià)值不高。因此，部分學(xué)者開始在實(shí)驗(yàn)室條件下探討生產(chǎn)單倍體植株的方法，以期在短期內(nèi)獲得純合體，縮短育種進(jìn)程。1953年，Tulecke首次通過(guò)培養(yǎng)銀杏花粉成功得到愈傷組織，但最終并未長(zhǎng)成完整植株[1]。1964年，研究人員利用曼陀羅（Datura stramonium L.）花藥培育出完整的單倍體植株，自此單倍體育種逐漸成為研究熱點(diǎn)。游離小孢子培養(yǎng)是單倍體育種方法之一，它是在花藥培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，不經(jīng)過(guò)任何形式的花藥預(yù)培養(yǎng)，直接從花蕾或花藥中獲得游離的、新鮮的小孢子群體進(jìn)行培養(yǎng)[2]。1982年，Lichter首次通過(guò)培養(yǎng)甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）花粉成功獲得單倍體植株[3]，從此開創(chuàng)了游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)。目前，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)已逐漸變成重要的育種方法，但關(guān)于花卉方面的研究較少。本研究對(duì)近年來(lái)觀賞植物小孢子培養(yǎng)進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1觀賞植物游離小孢子培養(yǎng)現(xiàn)狀

目前游離小孢子培養(yǎng)成功的觀賞植物主要集中在草本植物，涉及的科屬較為廣泛。其中培養(yǎng)成功的十字花科植物有2例，十字花科蔬菜類植物是迄今為止胚誘導(dǎo)成功并長(zhǎng)成植株最多的科屬，這可能是由于十字花科植物基因?qū)ε哒T導(dǎo)響應(yīng)能力較強(qiáng)，同時(shí)也與人們對(duì)蔬菜作物育種較為重視有關(guān)（表1）。菊科植物基因在小孢子培養(yǎng)方面可能具有頑拗性，導(dǎo)致其胚發(fā)生較為困難。

2小孢子培養(yǎng)技術(shù)

2.1預(yù)處理方法

小孢子培養(yǎng)所用的花序經(jīng)常采用10 ℃以下的低溫進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理時(shí)間不等，通常為24～48 h。有學(xué)者認(rèn)為，低溫可以誘導(dǎo)玉米、小麥、水稻等植物小孢子胚狀體發(fā)育[19-20]。低溫也可以提高煙草胚性花粉數(shù)，進(jìn)而發(fā)育成胚胎[21-22]。朱彥濤等對(duì)長(zhǎng)0～40 cm的甘藍(lán)型油菜花序低溫處理 0～10 d，發(fā)現(xiàn)處理時(shí)間隨著花序長(zhǎng)度的增加而延長(zhǎng)，適當(dāng)?shù)牡蜏靥幚砜梢匝泳徯℃咦拥耐嘶俣?，從而延長(zhǎng)材料的保存時(shí)間，但保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，胚產(chǎn)量下降[23]。在一些植物的游離小孢子培養(yǎng)中，不進(jìn)行花蕾預(yù)處理同樣可以獲得胚狀體，因此，有學(xué)者認(rèn)為，對(duì)于某些植物的花蕾進(jìn)行低溫預(yù)處理是不必要的[24]。對(duì)于某些植物來(lái)說(shuō)，對(duì)花粉進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理是不可缺少的。

2.2分離純化技術(shù)

分離是將小孢子從花藥中分離出來(lái)，純化即篩選胚性小孢子，淘汰非胚性小孢子，分離純化有利于提高胚發(fā)生率，分離技術(shù)主要包括以下3種。

2.2.1擠壓法將花藥置于盛有少量液體培養(yǎng)基的容器中，用玻璃棒或其他工具進(jìn)行擠壓，將花粉釋放出來(lái)，此種方法比較適合雙子葉植物，缺點(diǎn)是獲得的花粉中可能混有體細(xì)胞，同時(shí)花粉密度不易控制[27-28]。

2.2.2自然散落法把花藥接在液體培養(yǎng)基上一段時(shí)間，使小孢子從自然開裂的藥室中散落出來(lái)，此方法不會(huì)對(duì)花粉粒造成損傷，但無(wú)法充分分離花粉[25，28-30]。

2.2.3機(jī)械游離法

2.2.3.1磁攪拌法用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液及滲透壓穩(wěn)定劑中的花藥，使花粉游離出來(lái)，這種方法會(huì)對(duì)花粉造成不同程度的機(jī)械損傷[27]。

2.2.3.2超速旋切法微型攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)切刀可以破碎花蕾等，使小孢子游離出來(lái)。1989年Swanson等首先運(yùn)用這種方法分離了油菜小孢子，之后這種方法在禾本科植物花粉分離及培養(yǎng)上得到廣泛應(yīng)用[31]。譚德冠等采用直接研磨法與間接研磨法對(duì)巴西橡膠樹游離小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)間接研磨法較為適宜[25]。間接研磨法應(yīng)去除花瓣、花萼，僅對(duì)雄蕊進(jìn)行研磨分離，直接研磨法是對(duì)整朵雄花進(jìn)行研磨，相比較而言，間接法雖然工作量大，但可以有效減少污染，同時(shí)分離出雜質(zhì)較少的小孢子。植物游離小孢子培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)小孢子進(jìn)行純化是不可缺少的環(huán)節(jié)，純化可以減少植物體細(xì)胞以及非胚性小孢子對(duì)小孢子培養(yǎng)的影響。小孢子純化方法主要包括蔗糖濃度梯度法[32]、percoll密度梯度法[33]、麥芽糖濃度梯度離心法等方法，其中percoll方法效果最好。采用不連續(xù)percoll密度梯度離心法篩選胚性小孢子，可以將大量無(wú)胚性小孢子淘汰掉，提高產(chǎn)胚率。這種不連續(xù)percoll密度梯度離心方法要優(yōu)于普通的蔗糖、聚蔗糖密度梯度離心法，但這種方法成本相對(duì)較高，因此應(yīng)用并不廣泛[34-36]。

2.3花粉培養(yǎng)方法

2.3.1直接培養(yǎng)法直接培養(yǎng)法即對(duì)花藥不作任何預(yù)處理，直接分離出花粉并接種于培養(yǎng)基上。1981年，研究人員通過(guò)這種培養(yǎng)方式得到芍藥愈傷組織繼而獲得單倍體植株。同年，陳英等也通過(guò)此方法誘導(dǎo)得到水稻植株[37]。

2.3.2花藥預(yù)培養(yǎng)后分離花粉法花藥預(yù)培養(yǎng)后分離花粉法即對(duì)花藥進(jìn)行一定的預(yù)處理（如低溫處理等），然后分離出花粉，將其置于液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，此方法應(yīng)用較為普遍。endprint

2.3.3添加花藥提取物的花粉培養(yǎng)法先將花藥接種在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周左右，然后取出花藥，將花藥浸入沸水中，再進(jìn)行研磨離心，保留上清液，將上清液過(guò)濾滅菌加入培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)花粉粒。很多學(xué)者在研究大麥花粉發(fā)育時(shí)采用此方法培養(yǎng)花粉粒[38-39]。

2.3.4哺育培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)已經(jīng)裂開的胚狀體或愈傷組織誘導(dǎo)率高的花藥作為哺育組織，此種花藥可以是不同種植物，將需要培養(yǎng)的花粉接種到花藥里進(jìn)行哺育培養(yǎng)。Sharp等曾經(jīng)利用這種方法誘導(dǎo)番茄花粉形成單倍體細(xì)胞無(wú)性系，但最終未能誘導(dǎo)成植株[40]。

2.3.5微室培養(yǎng)用蓋玻片或載玻片制作成微室，將花粉粒接種在裝有培養(yǎng)基的微室中進(jìn)行培養(yǎng)。1977年，谷明光等曾用此法成功將煙草花粉誘導(dǎo)成胚狀體[41]。

3小孢子研究影響因素

3.1材料基因型

植物的基因型對(duì)游離小孢子培養(yǎng)過(guò)程中胚狀體及愈傷組織的發(fā)生尤為關(guān)鍵。Takahata等研究了11種不同基因型蘿卜的胚誘導(dǎo)能力，發(fā)現(xiàn)有5種不同基因型的蘿卜對(duì)誘導(dǎo)不響應(yīng)，不能產(chǎn)生胚狀體。2007年，馮輝等研究了18種不同基因型羽衣甘藍(lán)F1代雜交種獲得胚狀體的比例，結(jié)果顯示，皺葉紅心胚狀體產(chǎn)率最高，紅珊瑚、白珊瑚、紅珊瑚3個(gè)品種都無(wú)胚狀體產(chǎn)生[42]。這可能是由于在植物的基因組中存在調(diào)控植物小孢子啟動(dòng)的基因，不同植物的啟動(dòng)基因表達(dá)所需的條件不同。

3.2植株生長(zhǎng)狀況

植株生長(zhǎng)狀況直接關(guān)系到花粉的發(fā)育狀態(tài)，從而影響植物游離小孢子試驗(yàn)成功與否。植物生長(zhǎng)健壯是獲得胚狀體及愈傷組織的首要條件。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)油菜供體植株生長(zhǎng)狀況良好時(shí)可直接誘導(dǎo)小孢子發(fā)育同步化，提高單核期小孢子的核質(zhì)指數(shù)及產(chǎn)胚量[43]。研究表明，在溫室中生長(zhǎng)的植株小孢子誘導(dǎo)率低于生長(zhǎng)在大田中的植株[44]。

3.3小孢子發(fā)育階段

小孢子發(fā)育階段主要包括單核早期、單核中期、單核晚期（即單核靠邊期）、雙核期等。研究認(rèn)為，單核中期之前的花粉過(guò)于幼嫩，雙核早期之后的花粉太過(guò)成熟。對(duì)于大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，單核中晚期到雙核早期是最適合的小孢子發(fā)育階段，單核晚期成胚率最大。對(duì)于不同基因型的植物來(lái)說(shuō)，其最適階段稍有差異，可以通過(guò)使用染色劑如醋酸洋紅、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）來(lái)確定發(fā)育時(shí)期。應(yīng)根據(jù)不同植物品種選擇對(duì)應(yīng)時(shí)期的花蕾。選擇合適的洛神葵植物時(shí)，Ma′arup 等選取直徑為0.8～1.0 cm的花蕾，發(fā)現(xiàn)此時(shí)的花蕾包括98%單核期小孢子及2%雙核期小孢子[11]。

3.4培養(yǎng)基類型及其他附加成分

目前還沒(méi)有1種可以普遍應(yīng)用于植物游離小孢子培養(yǎng)的培養(yǎng)基。Maarup等在誘導(dǎo)山茶小孢子胚過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)率要高于N6培養(yǎng)基，液體MS培養(yǎng)基也適合洛神葵游離小孢子培養(yǎng)[11]。在馬蹄蓮游離小孢子培養(yǎng)中，Wang等使用了NLN、N6、B5、Nitsch等4種培養(yǎng)基，結(jié)果表明，NLN培養(yǎng)基中小孢子成胚率最高[10]。對(duì)于某些植物來(lái)說(shuō)，加入激素可以提高胚狀體產(chǎn)出率，激素成分以及濃度隨植物品種的變化而變化。常用的激素有NAA、6-BA、2，4-D、TDZ、KT等。研究人員搭配使用2，4-D與NAA 2種激素進(jìn)行芍藥的小孢子培養(yǎng)，結(jié)果表明，2 mg/L NAA條件下，小孢子分化率最高[4]。并不是所有植物進(jìn)行胚誘導(dǎo)時(shí)都需要加入激素。碳源的種類及濃度與胚狀體發(fā)生也密切相關(guān)。Kim等比較了不同濃度蔗糖、麥芽糖對(duì)辣椒（Capsicum annuum L.）胚胎誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)9%蔗糖是誘導(dǎo)辣椒胚胎發(fā)育的最佳碳源[45]。活性炭是一種良好的吸附劑，被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)[46-47]。

3.5小孢子培養(yǎng)密度

小孢子的培養(yǎng)密度對(duì)胚狀體及愈傷組織的獲得也有很大影響。付文婷等在大白菜游離小孢子胚誘導(dǎo)過(guò)程中將小孢子培養(yǎng)密度調(diào)整為1×104個(gè)/mL[48]。在蘆筍游離小孢子培養(yǎng)過(guò)程中，湯泳萍等將小孢子密度調(diào)整為1.5×105個(gè)/mL[49]。當(dāng)小孢子密度低于5×104個(gè)/mL時(shí)，最適合大麥集群化生長(zhǎng)[50]。細(xì)胞密度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)與分裂影響極大。細(xì)胞能夠合成某些分裂時(shí)所必需的化合物，只有當(dāng)這些化合物的內(nèi)生濃度達(dá)到臨界值后，細(xì)胞才能進(jìn)行分裂?？梢?jiàn)，懸浮培養(yǎng)時(shí)小孢子密度會(huì)直接影響胚發(fā)生率，密度過(guò)高時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)被耗盡，同時(shí)細(xì)胞會(huì)釋放某些有毒物質(zhì)，影響其他小孢子胚的發(fā)生，但細(xì)胞生長(zhǎng)具有群體效應(yīng)，密度過(guò)低又會(huì)導(dǎo)致小孢子無(wú)法正常生長(zhǎng)，極大地降低成胚率。

4存在的問(wèn)題

目前游離小孢子培養(yǎng)在洋甘菊、一枝黃花、蛇目菊、纈草等很多菊科植物中都以失敗而告終[51]。游離小孢子培養(yǎng)成功與否受到基因型、生長(zhǎng)環(huán)境、培養(yǎng)基成分等的影響。同時(shí)，花蕾預(yù)處理、分離純化、花粉培養(yǎng)方法也影響胚誘導(dǎo)能否成功。游離小孢子培養(yǎng)雖然避免了體細(xì)胞的影響，但花粉也失去了花藥壁的保護(hù)，有時(shí)有極少的二倍體、多倍體植株發(fā)育。觀賞植物的游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)目前尚不成熟，盡管前人已經(jīng)從小孢子胚胎發(fā)生的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、代謝水平、分子水平等方面探究了小孢子胚胎發(fā)生機(jī)制，但觀賞植物游離小孢子培養(yǎng)獲得單倍體植株的誘導(dǎo)機(jī)制、啟動(dòng)機(jī)理、發(fā)育途徑等尚不明確，嚴(yán)重阻礙了觀賞植物游離小孢子育種進(jìn)程。

5展望

原始的雜交育種方式存在育種周期長(zhǎng)、效率低、管理繁瑣等問(wèn)題，單倍體育種具有育種年限短、選擇效率高等優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，基因工程采用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，可以為植物育種及基因定位生產(chǎn)雙單倍體（即重組自交系），以克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性。在誘導(dǎo)胚狀體過(guò)程中花粉容易產(chǎn)生變異，因此，游離小孢子育種還可作為引發(fā)突變的手段。研究游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)、探討影響觀賞植物游離小孢子培養(yǎng)的因素、提高小孢子誘導(dǎo)率，是探究游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)中亟需解決的難題。

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